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前言
生物療法已被批準用于許多疾病的治療。與傳統(tǒng)的小分子相比，生物療法有許多優(yōu)勢，但其有可能誘導生物體產(chǎn)生針對自身的免疫反應，形成抗藥物抗體（anti-drug antibodies,，ADA），進而產(chǎn)生各類副作用。中和抗體（Neutralizing antibody，NAb）是一個特殊的ADA亞種群，能夠抑制生物藥的生物活性從而減弱其藥效?？紤]到ADA和NAb會嚴重影響藥物使用的有效性和安全性，在抗體藥物研發(fā)過程中必須要進行免疫原性檢測。
基于細胞的功能性NAb試驗是一種常用段來檢測其中和活性。但是這種檢測技術往往容易受到體內(nèi)藥物循環(huán)以及來自多種血清因子（包括但不限于生長因子和疾病相關細胞因子）的干擾。因此，酸解磁珠提取法（Bead Extraction with Acid Dissociation，BEAD）被成功創(chuàng)造并應用于從樣本中去除循環(huán)藥物或其他干擾因素，從而富集ADA/NAb。但該技術在萃取過程中使用的強酸會導致NAb發(fā)生不可逆變性，從而導致NAb的測量值被低估。為避免這一現(xiàn)象，本次將為大家介紹一種新的技術：熱解離磁珠提取法（Bead Extraction with Heat Dissociation，BEHD）。該技術通過利用不同蛋白結(jié)構(gòu)所對應的耐熱性不同，來特異性地使藥物本身發(fā)生不可逆變性，從而使樣品中仍存在活性的ADA/NAb免疫復合物被更好地檢測到。
BEHD的實驗流程
1、將100 μL對照品或樣品添加到96孔板內(nèi)，用封板膜覆蓋， 62°C，400 rpm恒溫振蕩孵育40 - 60分鐘。
2、取出96孔板，待冷卻約15 min后，加入生物素化藥物28 μL（50 μg/mL，用含1% BSA的DPBS稀釋)，2-8℃，1000 rpm振蕩過夜。
3、將包含ADA—生物素化藥物的復合物振蕩孵育固定在250 μg鏈霉素親和素包被的磁珠上。
4、將磁珠吸附復合物用600 μL的 PBST清洗2次，用60 μL的2×RPMI-1640洗脫。
5、將50 μL洗脫液轉(zhuǎn)移到含有22 μL 100 mM HEPES的新的96孔板上。
6、后續(xù)操作參考常規(guī)實驗步驟。
實驗結(jié)果
1、實驗藥物和陽性對照的熱穩(wěn)定性
藥物和NAb對于溫度的耐受差異是BEHD的一個核心問題。因而，本文首先比較了實驗藥物與多組抗實驗藥物的NAb PCs（陽性抗體）的熱穩(wěn)定性。如圖1A和表1所示，實驗藥物在62°C幾乎都已變性，而大部分NAb PCs在此溫度下仍能保持結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定。其中熱穩(wěn)定性最佳的為Rabbit pAb NAb PCs。
為了進一步確認實驗藥物和NAb PCs熱穩(wěn)定性的不同，將兩者在不同溫度下加熱50-60 min，然后檢測藥物和NAb PCs剩余活性。如圖1B和1C所示，在62°C的情況下，濃度等于或低于0.5 μg/mL的藥物其活性顯著降低。相反，不同劑量的NAb PCs在所測試的溫度下都保留了活性。
上述結(jié)果表明，在62°C下，大多數(shù)藥物發(fā)生了不可逆的變性，而所有檢測的NAb PCs仍能保留活性。
2、加熱代替酸處理提高抗實驗藥物 NAb的回收率
BEHD與BEAD的主要區(qū)別在于第一步是對樣品進行熱處理或酸處理。為了評估熱處理與酸處理的效果，作者比較了經(jīng)兩種手段分別處理后的Rabbit pAb Nab PCs的相對活性。如表2所示，62°C加熱分解藥物/NAb免疫復合物后，NAb的相對活性明顯優(yōu)于酸處理。
那是否是因為這類Rabbit pAb Nab PCs對酸處理過于敏感導致其不適用于酸處理的方法呢？因此，作者設計了一種在較低pH環(huán)境下能保持更高活性的PC——13H4。從表2可知，13H4在兩種處理下的表現(xiàn)也如同之前的PCs一樣。這表明相較于酸處理，熱處理更能保持NAb的相對活性，提高其回收率。
表2
結(jié)論
隨著生物藥物結(jié)構(gòu)、作用位點的不斷創(chuàng)新，許多ADA/NAb陽性抗體不能承受苛刻的酸處理，這直接導致了ADA/NAb回收率低，例如有聚乙二醇化結(jié)構(gòu)域的抗體就不耐受低pH的環(huán)境。因此創(chuàng)造一種不基于“酸處理”的方法顯得十分重要。在本文中，作者也驗證了熱解離磁珠提取法（BEHD）法具有良好的耐藥性、精密度和靈敏度，可應用于免疫安全性檢測實驗中。然而，該方法也存在一定局限性。此方法的前提是實驗室需具備特殊儀器用于檢測相關蛋白的耐熱情況。并且，它只適用于ADA/NAb陽性抗體的耐熱性高于藥物蛋白本身的實驗方法。
同時，該方法跳出常規(guī)實驗思路，從蛋白的基本物理性質(zhì)層面去優(yōu)化實驗步驟，也為我們之后的方法開發(fā)提供了一個新角度。
參考文獻
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