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熙寧快訊
強(qiáng)強(qiáng)聯(lián)合，恒瑞和熙寧團(tuán)隊(duì)成功開(kāi)發(fā)首個(gè)基于流式細(xì)胞術(shù)，檢測(cè)ERK磷酸化蛋白的方法，支持SHP2抑制劑的臨床開(kāi)發(fā)
近日，從熙寧生物分析實(shí)驗(yàn)室傳來(lái)好消息，經(jīng)過(guò)3個(gè)多月的努力。恒瑞醫(yī)藥biomarker團(tuán)隊(duì)和熙寧生物項(xiàng)目團(tuán)隊(duì)（以下簡(jiǎn)稱(chēng)恒瑞和熙寧團(tuán)隊(duì)），成功開(kāi)發(fā)出基于流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)ERK磷酸化蛋白的方法，該方法將作為重要的PD指標(biāo)支持恒瑞醫(yī)藥SHP2抑制劑的臨床開(kāi)發(fā)。
一、 SHP2的結(jié)構(gòu)和功能
SHP2（PTPN11基因編碼）是一個(gè)由593個(gè)氨基酸組成的經(jīng)典非受體蛋白酪氨酸磷酸酶，它包含兩個(gè)Src同源2結(jié)構(gòu)域（N-SH2和C-SH2）和一個(gè)PTP（蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酶）催化域，是PTP家族中唯一一個(gè)原癌基因。
二、 SHP2與腫瘤
SHP2在大多數(shù)組織中廣泛表達(dá)，并在各種細(xì)胞信號(hào)事件中起調(diào)節(jié)作用，對(duì)于促有絲分裂、代謝控制、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、細(xì)胞遷移等多種細(xì)胞功能非常重要。SHP2是人類(lèi)中經(jīng)過(guò)充分驗(yàn)證的PTP癌蛋白，并且正在成為治療癌癥的重要靶標(biāo)。PTPN11的功能獲得性突變見(jiàn)于約50％的發(fā)育異常Noonan綜合征（NS）病例中和超過(guò)30％的最常見(jiàn)的小兒白血??；種系PTPN11突變?cè)?0％的LEOPARD綜合征（LS）患者中被發(fā)現(xiàn)；突變還發(fā)生在散發(fā)性實(shí)體瘤中，包括肺癌，結(jié)腸癌，神經(jīng)母細(xì)胞瘤和黑色素瘤（下圖A）。根據(jù)《癌癥體細(xì)胞突變目錄》（COSMIC）中精選的數(shù)據(jù)，腫瘤樣本中有75.5％攜帶PTPN11錯(cuò)義突變，并在N-SH2和PTP域中更頻繁地發(fā)生（下圖B）。
在實(shí)體瘤中很少發(fā)現(xiàn)SHP2突變，而SHP2的過(guò)度激活起著至關(guān)重要的致病作用，因此通過(guò)阻斷或抑制SHP2的通路激活可以明顯改善腫瘤治療，其中包括（1）SHP2敲除可顯著抑制腫瘤細(xì)胞的維持和發(fā)展；（2）抑制SHP2可以抑制RTK驅(qū)動(dòng)的癌細(xì)胞（如EGFRL858R驅(qū)動(dòng)的肺腺癌，BRAF突變的結(jié)腸癌和KRAS突變的乳腺癌）的生長(zhǎng)并增強(qiáng)RTK抑制劑的治療效果；（3）阻斷SHP2，誘導(dǎo)腫瘤衰老，從而觸發(fā)免疫系統(tǒng)清除癌細(xì)胞。
三、 SHP2信號(hào)傳導(dǎo)通路
SHP2位于細(xì)胞質(zhì)中，可被RTK募集以誘導(dǎo)細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)，并參與多個(gè)細(xì)胞內(nèi)致癌信號(hào)傳導(dǎo)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，例如Jak / STAT，PI3K / AKT，RAS / Raf / MAPK，PD-1 / PD-L1 ，以及mTOR途徑。其中將胞外信號(hào)傳導(dǎo)到核內(nèi)的關(guān)鍵GTP酶RAS，被SHP2調(diào)節(jié)（銜接子/支架蛋白中的酪氨酸去磷酸化）成為活化狀態(tài)的GTP結(jié)合模式發(fā)揮致癌作用；另一方面，在獲得性耐藥中SHP2對(duì)RAS信號(hào)激活促進(jìn)了信號(hào)通路的代償性激活（如MEK的負(fù)反饋調(diào)節(jié)激活RTK，活化SHP2從而激活下游通路），在這種情況下，對(duì)SHP2的抑制作用可以消除RAS / Raf / ERK途徑的重新激活，并代表一種潛在的治療策略，作為一種新的解決RTK耐藥問(wèn)題的策略（下圖C）。
另一方面，在免疫微環(huán)境中， PD-1通過(guò)ITIM / ITSM結(jié)構(gòu)域募集SHP2可以阻止T細(xì)胞通過(guò)TCR和共刺激CD28激活T細(xì)胞活化信號(hào)，從而抑制下游通路以降低腫瘤負(fù)荷，包括PI3K / AKT，RAS / Raf和PLCγ。總的來(lái)說(shuō)，SHP2的抑制作用通過(guò)降低細(xì)胞因子表達(dá)和T細(xì)胞活化、增殖、存活而抑制T細(xì)胞依賴(lài)性免疫反應(yīng)（下圖D）。因此可以通過(guò)抑制SHP2從而恢復(fù)Th1免疫功能（主要介導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答）和活化T細(xì)胞，進(jìn)而激活腫瘤微環(huán)境中的免疫應(yīng)答，鑒于抗PD-1 / PD-L1治療藥物的成功， SHP2抑制劑與免疫檢查點(diǎn)抑制劑聯(lián)合用于癌癥免疫治療具有潛在可能性。
四、 SHP2抑制——“一石多鳥(niǎo)”的腫瘤治療策略
SHP2被認(rèn)為是一個(gè)理想的癌癥干預(yù)靶標(biāo)，這是因?yàn)镾HP2是多條激活RAS信號(hào)通路的共有節(jié)點(diǎn)，激活RAS對(duì)癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和存活都非常重要，因此抑制SHP可在抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)的同時(shí)，解除免疫細(xì)胞的免疫抑制，增強(qiáng)抗腫瘤免疫活性，是一種“一石多鳥(niǎo)”的腫瘤治療策略。
五、 SHP2靶點(diǎn)抑制劑在研藥物
全球 SHP2 抑制劑尚無(wú)產(chǎn)品上市，進(jìn)入臨床階段開(kāi)發(fā)的品種較少。目前，進(jìn)入臨床的 SHP2 抑制劑主要包括諾華的 TNO155 （II 期），Revolution Medicines / 賽諾菲共同研發(fā) RMC-4630（II 期）、Relay Therapeutics 公司開(kāi)發(fā)的 RLY-1971（I 期），Navire Pharma Inc. 公司開(kāi)發(fā)的 BBP-398（I 期），Erasca公司開(kāi)發(fā)的ERAS-601（I 期），以及國(guó)內(nèi)藥企北京加科思開(kāi)發(fā)的 JAB-3068（IIa 期）、JAB-3312（I 期）、諾誠(chéng)健華的 ICP-189、奕拓醫(yī)藥的ET0038、圣和藥業(yè)的SH3809等。相信隨著研究的深入，會(huì)有越來(lái)越多的醫(yī)藥企業(yè)加入到SHP2的研發(fā)行列中，SHP2靶點(diǎn)將有望成為小分子藥物的中PD-1。
六、 SHP2 抑制劑臨床PD指標(biāo)
通過(guò)查閱https://clinicaltrials.gov/網(wǎng)站上個(gè)SHP2抑制劑的公開(kāi)信息，發(fā)現(xiàn)主要的PD指標(biāo)如下：
表1，SHP2抑制劑臨床開(kāi)發(fā)中主要的PD指標(biāo)
Title | PD Marker |
RLY-1971 in Subjects With Advanced or Metastatic Solid Tumors | Changes in phospho-ERK levels [ Time Frame: At the beginning of Cycle 1 Day 1 post and pre ] |
A First in Human, Dose Escalation Study of JAB-3068 （SHP2 Inhibitor） in Adult Patients With Advanced Solid Tumors | pERK [ Time Frame: Approximately 2 years ] |
A Dose Escalation/Expansion Study of ERAS-601 in Patients With Advanced or Metastatic Solid Tumors (FLAGSHP-1) | Pharmacodynamic assessment [ Time Frame: Assessed up to 24 months from time of first dose ] |
七、 恒瑞和熙寧團(tuán)隊(duì)開(kāi)發(fā)的基于流式細(xì)胞術(shù)的pERK檢測(cè)方法
在方法開(kāi)發(fā)進(jìn)行前，恒瑞與熙寧團(tuán)隊(duì)就進(jìn)行了多輪的討論。討論主要針對(duì)以下幾個(gè)方面展開(kāi)：
1. 能否使用采集后的外周血直接進(jìn)行pERK的檢測(cè)，比較給藥前后pERK水平的變化，進(jìn)行PD的評(píng)估？
2. 如果不能直接檢測(cè)，可以使用的刺激劑有哪些？
3. 需要檢測(cè)哪些細(xì)胞亞群上pERK 水平的變化？
結(jié)合SHP2的信號(hào)通路，以及恒瑞和熙寧團(tuán)隊(duì)豐富的磷酸化蛋白檢測(cè)經(jīng)驗(yàn)。經(jīng)過(guò)初期的實(shí)驗(yàn)測(cè)試，團(tuán)隊(duì)證明在健康人外周血或者PBMC中，pERK的水平很低，所以無(wú)法通過(guò)比較給藥前pERK水平與給藥后pERK水平，確認(rèn)SHP2蛋白的抑制效果。
通過(guò)查閱大量文獻(xiàn)和數(shù)次討論，恒瑞biomarker和熙寧團(tuán)隊(duì)選擇并測(cè)試了20余種不同的重組蛋白、抗體、小分子刺激劑等，最終找到了合適的刺激劑。
從表1可以看出，加入不同濃度的刺激劑，在沒(méi)有SHP2抑制劑的情況下，pERK信號(hào)值變化明顯，而加入高濃度的SHP2抑制劑，pERK信號(hào)值基本無(wú)變化。從表2可以看出，加入高濃度的抑制劑，pERK信號(hào)值很低，而隨著SHP2抑制劑濃度的降低，pERK信號(hào)值逐漸升高。通過(guò)以上兩組數(shù)據(jù)，我們可以判斷，我們篩選到合適的刺激劑，可以刺激特定細(xì)胞亞群的pERK水平增加，而該pERK的增加，可以被SHP2抑制劑特異性的抑制。
表1，不同的刺激劑濃度下，pERK信號(hào)值的變化
表2，同一刺激劑濃度，不同濃度的SHP2抑制劑對(duì)于pERK信號(hào)的抑制
綜上，恒瑞和熙寧團(tuán)隊(duì)經(jīng)過(guò)不懈的努力，成功開(kāi)發(fā)出基于流式細(xì)胞術(shù)的pERK檢測(cè)方法用于支持SHP2抑制劑項(xiàng)目的臨床PD檢測(cè)，該方法可以檢測(cè)外周血中某特定細(xì)胞亞群中pERK水平的變化。具有靈敏度高，特異性好，操作簡(jiǎn)便，費(fèi)用較低等很多優(yōu)點(diǎn)。
恒瑞醫(yī)藥作為國(guó)內(nèi)醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)的領(lǐng)頭羊，已經(jīng)加入SHP2抑制劑的賽道中。據(jù)悉，恒瑞醫(yī)藥SHP2抑制劑產(chǎn)品已經(jīng)收到國(guó)家藥品監(jiān)督管理局核準(zhǔn)簽發(fā)的《藥物臨床試驗(yàn)批準(zhǔn)通知書(shū)》，將于近期開(kāi)展臨床試驗(yàn)。相信，因?yàn)楹闳鸷臀鯇幧镩_(kāi)發(fā)出合適的PD評(píng)價(jià)指標(biāo)，會(huì)使該藥物的臨床評(píng)價(jià)更加的高效，進(jìn)而加快臨床的進(jìn)度，實(shí)現(xiàn)該藥物早日上市，造福廣大病患。
參考信息：
下一個(gè)重磅炸彈：SHP2抑制劑研發(fā)進(jìn)展。
SHP2抑制劑：一遇風(fēng)云便化龍。
中國(guó)領(lǐng)跑，大廠布局，一文揭開(kāi)腫瘤免疫新靶點(diǎn)SHP2的“廬山真面目”。
SHP2別構(gòu)抑制劑：小分子藥物“復(fù)興”？。
奕拓醫(yī)藥SHP2變構(gòu)抑制劑獲FDA批準(zhǔn)IND 國(guó)內(nèi)還有這些藥企在布局。
關(guān)于恒瑞醫(yī)藥
恒瑞醫(yī)藥是一家從事醫(yī)藥創(chuàng)新和高品質(zhì)藥品研發(fā)、生產(chǎn)及推廣的醫(yī)藥健康企業(yè)，創(chuàng)建于1970年，2000年在上海證券交易所上市，是國(guó)內(nèi)股票市值最大的制藥上市企業(yè)。公司堅(jiān)持實(shí)施“科技創(chuàng)新”戰(zhàn)略，近年來(lái)每年投入銷(xiāo)售額15％左右的研發(fā)資金，在美國(guó)、歐洲、日本和中國(guó)多地建有研發(fā)中心或分支機(jī)構(gòu)，全球員工24000人，其中在歐美的海外員工200多人。公司是國(guó)家“重大新藥創(chuàng)制”專(zhuān)項(xiàng)孵化器基地、國(guó)家抗腫瘤藥技術(shù)創(chuàng)新產(chǎn)學(xué)研聯(lián)盟牽頭單位、國(guó)內(nèi)最具創(chuàng)新能力的制藥企業(yè)之一，建有國(guó)家靶向藥物工程技術(shù)研究中心、國(guó)家博士后科研工作站。
公司本著“科技為本，為人類(lèi)創(chuàng)造健康”的核心理念，致力于為全球患者提供優(yōu)質(zhì)可負(fù)擔(dān)的醫(yī)藥資源。公司抗腫瘤藥、手術(shù)麻醉類(lèi)用藥、特色輸液、造影劑市場(chǎng)份額在國(guó)內(nèi)市場(chǎng)名列前茅，也是唯一一家將注射劑規(guī)?；N(xiāo)往歐美日市場(chǎng)的中國(guó)制藥企業(yè)。
關(guān)于熙寧生物
熙寧生物是一家專(zhuān)業(yè)的符合國(guó)際GLP&GCP質(zhì)量管理規(guī)范的大分子生物分析實(shí)驗(yàn)室，為國(guó)內(nèi)外生物醫(yī)藥公司提供臨床和臨床前大分子生物分析的一站式服務(wù)，包括抗體制備，樣本采集包及實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，符合法規(guī)要求的分析方法的開(kāi)發(fā)和驗(yàn)證，以及樣本分析。包含藥代動(dòng)力學(xué)（PK），藥效動(dòng)力學(xué)（PD），抗藥抗體（ADA），中和抗體（NAb），生物標(biāo)志物（Biomarker）受體占位（RO），以及基于流式細(xì)胞術(shù)（FACS）和熒光定量PCR （qPCR）平臺(tái)的針對(duì)新型細(xì)胞治療（CAR-T ,CAR-NK)和基因治療藥物的PK, PD分析服務(wù)。 公司領(lǐng)導(dǎo)團(tuán)隊(duì)平均有近20年的專(zhuān)業(yè)經(jīng)驗(yàn)，多位在國(guó)際知名藥企和CRO工作多年的海歸博士、大分子生物分析專(zhuān)家、中美多個(gè)行業(yè)協(xié)會(huì)的常任理事，曾參與《中國(guó)藥典2015版》“生物樣品分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則”，及多個(gè)國(guó)際上行業(yè)白皮書(shū)的撰寫(xiě)，支持過(guò)200+全球多中心臨床試驗(yàn)，100+各類(lèi)大分子產(chǎn)品。為多個(gè)國(guó)際重磅級(jí)藥物提供上市審批數(shù)據(jù)支持。 公司在寧波（寧波熙寧檢測(cè)技術(shù)有限公司）、上海（上海精翰生物科技有限公司）、美國(guó)新澤西（Accurant Bio)都建有實(shí)驗(yàn)室。和國(guó)內(nèi)外超五十家一線藥企和生物科技公司建立了項(xiàng)目合作，涵蓋腫瘤免疫，自身免疫，降糖等多個(gè)熱門(mén)治療領(lǐng)域，包含多肽，重組蛋白，融合蛋白，單克隆抗體，雙特異性抗體，納米抗體，ADC和Car-T等各類(lèi)生物大分子。
