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隨著科技的不斷進(jìn)步，免疫組庫(kù)測(cè)序方法正為我們提供越來(lái)越深入的洞察力，揭示著免疫系統(tǒng)的奧秘。在本文中，我們將深入探討免疫組庫(kù)測(cè)序的方法和技術(shù)，解析其背后的科學(xué)原理，以及如何利用這一技術(shù)來(lái)揭示免疫系統(tǒng)的復(fù)雜性。通過(guò)了解免疫組庫(kù)測(cè)序的工作流程和應(yīng)用，我們可以更好地理解人體免疫系統(tǒng)如何應(yīng)對(duì)病原體侵襲、疾病發(fā)展以及免疫相關(guān)治療的潛在機(jī)制。本文將帶領(lǐng)您深入了解免疫組庫(kù)測(cè)序方法的精髓，讓我們一起走進(jìn)這個(gè)神奇的科學(xué)領(lǐng)域，探尋免疫系統(tǒng)的奧秘之旅！
PART 01
免疫組庫(kù)檢測(cè)方法
分析免疫系統(tǒng)的傳統(tǒng)方法，如流式細(xì)胞術(shù)和免疫顯微鏡光譜分型，存在諸多的局限性，費(fèi)時(shí)費(fèi)力且費(fèi)用昂貴[1]。
在下一代測(cè)序（NGS）技術(shù)之前，最常見(jiàn)的分析免疫受體的方法是Sanger測(cè)序，但Sanger測(cè)序數(shù)據(jù)通量較低，成本較高，運(yùn)行時(shí)間較長(zhǎng)。與Sanger測(cè)序相比，NGS可以以更低的成本、更高的通量和更短的運(yùn)行時(shí)間對(duì)免疫系統(tǒng)進(jìn)行更廣泛的檢測(cè)，因此，NGS技術(shù)成為免疫組庫(kù)檢測(cè)最常用的技術(shù)。NGS免疫組庫(kù)測(cè)序涉及幾個(gè)過(guò)程，包括細(xì)胞處理、核酸提取、文庫(kù)制備、測(cè)序和生物信息學(xué)分析（圖1）。
圖1 免疫組庫(kù)測(cè)序和分析過(guò)程[1]
PART 02
擴(kuò)增模板選擇
文庫(kù)制備是生成免疫組庫(kù)測(cè)序純文庫(kù)的基礎(chǔ)，文庫(kù)制備可以使用gDNA作為模板，使用V和J片段引物，或者使用cDNA作為模板，使用V前導(dǎo)引物、內(nèi)部V引物、J引物或恒定區(qū)引物（圖3）。除了體細(xì)胞突變對(duì)引物結(jié)合的潛在影響相關(guān)的考慮因素外，兩種原料模板各有優(yōu)劣，主要取決于檢測(cè)的目標(biāo)。gDNA與細(xì)胞數(shù)量成比例相關(guān)，因此通常用于計(jì)算抗原特異性或靶T/B細(xì)胞的比例；而信使核糖核酸與細(xì)胞功能/活化密切相關(guān)。
gDNA模板的優(yōu)勢(shì)是，它允許分析產(chǎn)生蛋白質(zhì)產(chǎn)物的有效重排基因序列，以及在V（D）J重排過(guò)程中非編碼重排基因序列，非編碼重排基因序列雖然不產(chǎn)生功能蛋白，但提供了Ig基因座重排特征的信息，如基因片段重排頻率、核酸外切酶進(jìn)行的片段消化以及非模板堿基插入水平。這可用于評(píng)估與受體基因重排或B細(xì)胞選擇相關(guān)的免疫表型，例如免疫缺陷疾病。每個(gè)細(xì)胞只有一個(gè)有效重排的TCR/BCR基因座，因此gDNA可評(píng)估細(xì)胞群中T/B細(xì)胞克隆的大小。相反，在單個(gè)T/B細(xì)胞內(nèi)會(huì)產(chǎn)生多個(gè)mRNA拷貝，并且TCR/BCR重排基因在不同細(xì)胞亞群中mRNA表達(dá)水平不同，例如在幼稚細(xì)胞中表達(dá)較低，在漿母細(xì)胞中的高表達(dá)，意味著如果只有單個(gè)RNA樣品可用于分析，則不能可靠地區(qū)分具有高TCR/BCR mRNA表達(dá)的細(xì)胞的存在。然而，使用RNA作為測(cè)序起始原料模板還有其他優(yōu)勢(shì)，主要是它能夠鑒定與特定V（D）J重排相關(guān)的重鏈類(lèi)型，RNA模板的另一個(gè)潛在優(yōu)勢(shì)是，它保留細(xì)胞樣品中存在的T/B細(xì)胞克隆的完整性，因?yàn)槊總€(gè)B細(xì)胞可以貢獻(xiàn)其TCR/BCR重排的多個(gè)mRNA拷貝，因此，如果在純化過(guò)程中丟失一些模板，樣品中代表的T/B細(xì)胞克隆的數(shù)量不會(huì)像gDNA那樣線性減少。最后，重排的gDNA片段僅占總DNA量的一小部分，而cDNA每ng擴(kuò)增的模板含有更多可擴(kuò)增的cDNA模板。由于可以添加到PCR反應(yīng)中的DNA模板的量是有限的，因此與gDNA模板相比，使用cDNA模板可以用更少的PCR反應(yīng)得到更復(fù)雜的BCR/TCR重排文庫(kù)（表1）。
表1 gDNA和mRNA作為文庫(kù)擴(kuò)增原料模板的優(yōu)劣[1]
PART 03
文庫(kù)構(gòu)建擴(kuò)增方法選擇
文庫(kù)制備的擴(kuò)增方法也是非常重要的，常用的方法有多重聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（mPCR）和5’RACE。mPCR使用混合引物來(lái)捕獲多個(gè)區(qū)域，引物設(shè)計(jì)主要集中在框架（FR）區(qū)域FR1、FR2和FR3上，該區(qū)域的突變相對(duì)少于CDR區(qū)更少，可能是由于框架（FR）區(qū)突變破壞抗體結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，導(dǎo)致B細(xì)胞在體內(nèi)的持久性受到影響。這種擴(kuò)增方法既可用于gDNA，也可用于mRNA。擴(kuò)增原理與普通聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)相似，只是引物數(shù)量增多。但不同引物之間存在效率差異和交叉反應(yīng)性，導(dǎo)致擴(kuò)增產(chǎn)物中引入偏差，需要對(duì)引物設(shè)計(jì)和引物濃度進(jìn)行優(yōu)化[1]。
5’RACE僅用于捕獲mRNA，一組基因特異性引物能夠與3’端基因片段互補(bǔ)結(jié)合，使用V、J或恒定區(qū)內(nèi)的引物，可以最大限度地減少引物偏倚和多重PCR引入的偏差，同時(shí)也有利于擴(kuò)增引物結(jié)合位點(diǎn)發(fā)生突變的lg序列。然而，對(duì)一個(gè)基因座上所有V基因片段分析顯示，一些可能具有短的5’非轉(zhuǎn)錄區(qū)（UTR）（短至30bp），而一些可能具有非常長(zhǎng)的5’UTR（高達(dá)9kb）（圖2，圖3）。因此，通過(guò)這種方法制作的文庫(kù)可能偏好于較短的序列，這種方法的擴(kuò)增建庫(kù)可能更復(fù)雜，需要RNA作為起始材料，缺少基因組DNA重排的分析，檢測(cè)性能受限于RNA樣本總量和質(zhì)量，以及逆轉(zhuǎn)錄酶的效率。總之，這兩種方法各有優(yōu)缺點(diǎn)（表2）。
圖2 TCR文庫(kù)構(gòu)建過(guò)程[4]
注：(A)多重聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的過(guò)程
(B) 5‘RACE的過(guò)程
圖3 使用gDNA或cDNA生產(chǎn)IgH文庫(kù)[3]
注：上圖顯示了編碼抗體重鏈的重排gDNA。左引物設(shè)計(jì)在框架1、2或3（FR1、FR2、FR3）區(qū)域（用帶圓圈的數(shù)字1、2和3標(biāo)記），互補(bǔ)右引物設(shè)計(jì)在與J基因片段互補(bǔ)區(qū)域（標(biāo)記4），PCR可擴(kuò)增VDJ基因重排。左側(cè)框架引物組顯示了多個(gè)引物，表明擴(kuò)增不同家族的V片段所需的不同引物。前導(dǎo)肽外顯子通過(guò)短內(nèi)含子與V片段分開(kāi)。下圖顯示了由編碼重鏈的成熟mRNA產(chǎn)生的cDNA。與恒定區(qū)雜交的引物（標(biāo)記為6）可以用作5’RACE方案的初始特異性引物，或者可以與前導(dǎo)序列中的引物（標(biāo)為5）或框架引物一起進(jìn)行PCR，擴(kuò)增VDJ基因重排。與VDJ基因重排相關(guān)的恒定區(qū)不同類(lèi)型可以在該文庫(kù)中進(jìn)行鑒別。
表2 mPCR和5’RACE兩種擴(kuò)增方法的優(yōu)劣[1]
免疫組庫(kù)測(cè)序是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，需要專(zhuān)業(yè)人員操作以便最大限度地減少測(cè)序錯(cuò)誤，在文庫(kù)制備和測(cè)序中都可能引入錯(cuò)誤，文庫(kù)制備可能會(huì)在核酸提取和PCR擴(kuò)增過(guò)程中引入錯(cuò)誤，而測(cè)序錯(cuò)誤源于不同的測(cè)序平臺(tái)以及測(cè)序上機(jī)文庫(kù)的濃度和純度。為了減少測(cè)序錯(cuò)誤，可以使用一些校正方法，如聚類(lèi)算法和獨(dú)特的DNA條形碼技術(shù)。聚類(lèi)算法的是通過(guò)將相似的序列分組在一起來(lái)降低測(cè)序誤差，獨(dú)特的DNA條形碼技術(shù)是添加獨(dú)特的分子標(biāo)簽（UMI），調(diào)整PCR過(guò)程中的誤差或擴(kuò)增偏差[1]。
PART 04
其他免疫組庫(kù)檢測(cè)技術(shù)
最近的研究中，RNA-seq也用于研究免疫系統(tǒng)，雖然該方法提供了更全面的基因表達(dá)信息，但這種方法并不能提供完整的轉(zhuǎn)錄組序列，但這對(duì)于在更多細(xì)胞中鑒定低豐度CDR3序列是必要的，因此，RNA-seq敏感性不足以進(jìn)行嚴(yán)格的免疫組庫(kù)分析[1]。另外還有新發(fā)展的單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)，基于流式細(xì)胞術(shù)、微流體設(shè)備和微孔板來(lái)分離單細(xì)胞，然后通過(guò)具有獨(dú)特條形碼的液滴或具有磁珠的乳液制備文庫(kù)，進(jìn)行高通量測(cè)序，單細(xì)胞分離技術(shù)與高通量測(cè)序技術(shù)相結(jié)合，有助于獲得單細(xì)胞高通量數(shù)據(jù)，可以剖析B細(xì)胞重鏈：輕鏈和T細(xì)胞α鏈：β鏈或δ鏈：γ鏈的配對(duì)信息，分析特定疾病抗體庫(kù)，但由于單細(xì)胞測(cè)序檢測(cè)成本高、檢測(cè)流程繁瑣、數(shù)據(jù)解讀分析復(fù)雜等問(wèn)題，整體適用范圍有限。
本文我們深入介紹了免疫組庫(kù)測(cè)序的方法和技術(shù)，解析了其在科學(xué)研究領(lǐng)域中的重要性和應(yīng)用。從測(cè)序樣本的準(zhǔn)備到數(shù)據(jù)分析的過(guò)程，一步步揭示了免疫組庫(kù)測(cè)序技術(shù)的精髓和復(fù)雜性，展現(xiàn)了這一技術(shù)在揭示免疫系統(tǒng)機(jī)制中的不可或缺的作用。
下一篇文章將帶您進(jìn)入免疫組庫(kù)測(cè)序在藥物研發(fā)中的應(yīng)用領(lǐng)域，探討免疫組庫(kù)測(cè)序如何在藥物研發(fā)過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，幫助研發(fā)人員更好地理解免疫系統(tǒng)在疾病治療中的作用機(jī)制，揭示潛在的藥物靶點(diǎn)和治療策略。
熙寧|精翰NGS實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用基于多重PCR建庫(kù)的免疫組庫(kù)檢測(cè)方法特異性地?cái)U(kuò)增TCR/Ig受體鏈編碼基因（TRB、TRD、TRG，以及IgH、IgL、IgK），檢測(cè)T/B細(xì)胞受體基因的克隆性重排，在時(shí)序樣本檢測(cè)中，通過(guò)檢測(cè)患者體內(nèi)TCR譜系的變化來(lái)評(píng)估治療效果以及跟蹤疾病進(jìn)展或復(fù)發(fā)。本檢測(cè)方法已經(jīng)經(jīng)過(guò)了完善的性能驗(yàn)證，可以供申辦方直接使用。歡迎您后臺(tái)留言咨詢(xún)。
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