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近些年腫瘤免疫療法迅速發(fā)展，諸如CART、TIL、雙抗等高效的免疫療法在臨床試驗(yàn)中已展現(xiàn)出明顯的腫瘤殺傷和臨床有效性，其中一些藥物已經(jīng)獲批上市，許多患者因此受益，生命得到延續(xù)。在這些藥物研究的過(guò)程中，細(xì)胞因子釋放綜合征作為一種常見(jiàn)的免疫治療不良反應(yīng)事件受到廣泛關(guān)注。
細(xì)胞因子屬于小分子蛋白質(zhì)，對(duì)細(xì)胞間的相互作用及信號(hào)傳導(dǎo)有影響。細(xì)胞因子包括淋巴因子、單核細(xì)胞因子、趨化因子、白介素等，既有促炎細(xì)胞因子也有抗炎細(xì)胞因子。有些細(xì)胞因子在適量情況下可以起到抑制腫瘤的作用，例如NK細(xì)胞受刺激后通過(guò)穿孔素/顆粒酶通路或凋亡誘導(dǎo)配體溶解腫瘤，分泌干擾素-γ，抑制腫瘤細(xì)胞增殖、增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞凋亡、調(diào)節(jié)抗原呈遞，抑制血管生成。免疫細(xì)胞在抵抗外來(lái)入侵或清除異常時(shí)會(huì)釋放大量促炎因子（如干擾素、白細(xì)胞介素、腫瘤壞死因子等）。當(dāng)免疫系統(tǒng)獲得勝利后，便會(huì)減少細(xì)胞因子的釋放，維持機(jī)體穩(wěn)態(tài)。然而，在進(jìn)行免疫治療時(shí)，如果免疫系統(tǒng)過(guò)度激活，便會(huì)產(chǎn)生過(guò)多的細(xì)胞因子，引發(fā)細(xì)胞因子風(fēng)暴。細(xì)胞因子風(fēng)暴又稱為細(xì)胞因子釋放綜合征（CRS），是一種常見(jiàn)的免疫治療并發(fā)癥，盡管這種不良反應(yīng)發(fā)生率比較低，但CRS一旦發(fā)生就會(huì)引發(fā)全身的炎癥反應(yīng)，嚴(yán)重時(shí)可能危及生命。
目前臨床上最常見(jiàn)的細(xì)胞因子風(fēng)暴檢測(cè)指標(biāo)包括IL-6、TNF-α、IFN-γ等，可以通過(guò)多因子組合進(jìn)行檢測(cè)以節(jié)省樣本體積和檢測(cè)成本，提高檢測(cè)效率。
細(xì)胞因子屬于生物標(biāo)志物的范疇，由于生物標(biāo)志物的復(fù)雜性，目前還沒(méi)有明確的方法驗(yàn)證指南文件。2018年版FDA發(fā)布的BMV指南中提到：當(dāng)生物標(biāo)志物數(shù)據(jù)用于支持監(jiān)管決策時(shí)，例如用于藥物安全性和/或有效性的重要決定，或用于支持藥物標(biāo)簽中的劑量說(shuō)明時(shí)，其分析方法應(yīng)得到充分驗(yàn)證。但同時(shí)，對(duì)于生物標(biāo)志物的方法學(xué)做到何種程度，建議基于fit for purpose原則來(lái)確定。例如：對(duì)于用于支持監(jiān)管決策的指標(biāo)，應(yīng)進(jìn)行完整驗(yàn)證，對(duì)于探索性指標(biāo)，進(jìn)行部分驗(yàn)證或方法測(cè)試。
方法的完整驗(yàn)證參考PK的驗(yàn)證要求，完整驗(yàn)證包括至少準(zhǔn)確度和精密度、平行性、基質(zhì)效應(yīng)、稀釋線性和穩(wěn)定性。
由于大多數(shù)生物標(biāo)志物在基質(zhì)中有一定的內(nèi)源性水平，標(biāo)準(zhǔn)曲線通常配制在緩沖液或替代基質(zhì)中，如果可以篩選到足夠的幾乎不含內(nèi)源性生物標(biāo)志物的基質(zhì)，也可以采取和PK相同的方式進(jìn)行方法學(xué)。
質(zhì)控樣品應(yīng)使用基質(zhì)來(lái)制備，優(yōu)先選擇合適內(nèi)源性水平的基質(zhì)作為各濃度水平的質(zhì)控樣品（ULOQ、HQC、MQC、LQC、LLOQ），如果沒(méi)有合適的內(nèi)源性基質(zhì)，可在基質(zhì)中加入適當(dāng)濃度的標(biāo)準(zhǔn)品來(lái)制備。
對(duì)于多因子檢測(cè)方法，由于同一個(gè)體基質(zhì)中不同因子的濃度水平可能會(huì)有較大差異，對(duì)于難以協(xié)調(diào)的因子，可以單獨(dú)設(shè)置其質(zhì)控樣品。
準(zhǔn)確度和精密度
準(zhǔn)確度和精密度的考察將通過(guò)6個(gè)分析批進(jìn)行，每個(gè)分析批包含一套標(biāo)準(zhǔn)曲線和三套五個(gè)水平的質(zhì)控樣品，用所有質(zhì)控樣品的濃度數(shù)據(jù)計(jì)算批內(nèi)和批間的準(zhǔn)確度和精密度。
各濃度水平的質(zhì)控樣品濃度可以在方法驗(yàn)證前采用至少三個(gè)分析批測(cè)定后取平均值來(lái)確定，也可以在方法驗(yàn)證期間的準(zhǔn)確度和精密度實(shí)驗(yàn)中確定。
平行性
由于生物標(biāo)志物所使用的重組蛋白標(biāo)準(zhǔn)品是一種替代參照品，和內(nèi)源性待測(cè)物并不完全一樣，所以生物標(biāo)志物的平行性考察尤為重要。平行性考察可以告訴我們替代標(biāo)準(zhǔn)品和內(nèi)源性待測(cè)物在檢測(cè)方法中的表現(xiàn)是否一致。通過(guò)將純基質(zhì)的樣品使用和配制標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品相同的稀釋液進(jìn)行序列稀釋，不同稀釋度的樣品乘以稀釋倍數(shù)后濃度之間的%CV在30%以內(nèi)，則平行性考察通過(guò)。
選擇性
選擇性，也可以稱為基質(zhì)效應(yīng)，可通過(guò)在個(gè)體基質(zhì)中分別加入高濃度和低濃度水平的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行考察，需要注意在計(jì)算回收率時(shí)要將內(nèi)源性水平考慮進(jìn)去。另一種方式是加入一定濃度的標(biāo)準(zhǔn)品后進(jìn)行序列稀釋，以第一濃度點(diǎn)作為參考值計(jì)算后續(xù)稀釋樣品點(diǎn)的偏差，也就是說(shuō)當(dāng)不同稀釋度的樣品點(diǎn)在乘以稀釋倍數(shù)后得到的濃度值接近時(shí)，就說(shuō)明含不同比例的基質(zhì)對(duì)檢測(cè)沒(méi)有影響，就可以認(rèn)為無(wú)基質(zhì)效應(yīng)。
稀釋線性
如果預(yù)期將來(lái)的樣品會(huì)產(chǎn)生高于定量上限的濃度，則需要證明稀釋線性。稀釋線性的考查方式和平行性類似，區(qū)別在于稀釋線性需要根據(jù)將來(lái)樣品的預(yù)期能達(dá)到的最高濃度配制加標(biāo)樣品，使用該高濃度加標(biāo)樣品作為起始樣品進(jìn)行稀釋后考察。在樣品預(yù)計(jì)的稀釋倍數(shù)不高于平行性中評(píng)估的稀釋倍數(shù)時(shí)，也可以基于平行性測(cè)試對(duì)稀釋線性進(jìn)行評(píng)估。
穩(wěn)定性
穩(wěn)定性包含室溫、2-8℃、凍融及長(zhǎng)期穩(wěn)定性。不同于PK方法，生物標(biāo)志物的穩(wěn)定性以基線測(cè)定濃度作為參考值進(jìn)行處理后樣品的評(píng)估。
熙寧生物|精翰生物積累了大量的細(xì)胞因子檢測(cè)經(jīng)驗(yàn)，對(duì)于常見(jiàn)的細(xì)胞因子已開(kāi)發(fā)相應(yīng)的自主產(chǎn)權(quán)方法學(xué)，如7因子方法學(xué)(IL-2、LI-4、IL-6、IL-8、IL-10、IFNγ、TNF-α)，10因子方法學(xué)等，可用于細(xì)胞因子釋放及臨床樣本的檢測(cè)，為申辦方節(jié)省方法學(xué)建立的時(shí)間和費(fèi)用成本。同時(shí)生物標(biāo)志物平臺(tái)目前已具備全面覆蓋不同樣本的檢測(cè)能力，從組織、細(xì)胞、蛋白、基因分子各個(gè)維度都可以提供相應(yīng)的檢測(cè)方案，歡迎各位交流咨詢。
已有生物標(biāo)志物自主產(chǎn)權(quán)方法(部分)
