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【概況】
重組腺相關(guān)病毒(rAAV)是基因治療關(guān)鍵的病毒載體，該病毒載體開發(fā)中主要挑戰(zhàn)來自大規(guī)模生產(chǎn)的上游與下游的工藝優(yōu)化和檢測(cè)方案的標(biāo)準(zhǔn)化，其中重組腺相關(guān)病毒(rAAV)基因組拷貝數(shù)的精確滴定與臨床前和臨床環(huán)境中正確給藥劑量直接相關(guān)，建立標(biāo)準(zhǔn)、準(zhǔn)確和可重復(fù)的重組腺相關(guān)病毒(rAAV)基因組拷貝數(shù)定量的方法是基因治療產(chǎn)品中工藝開發(fā)和優(yōu)化的重要環(huán)節(jié)。已有報(bào)道的，實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）技術(shù)用于重組腺相關(guān)病毒(rAAV)基因組拷貝數(shù)的滴定檢測(cè)存在標(biāo)準(zhǔn)品建立復(fù)雜和定量重復(fù)性差的問題，數(shù)字PCR（dPCR）技術(shù)作為一種新型PCR技術(shù)，可直接定量重組腺相關(guān)病毒(rAAV)基因組拷貝數(shù)、無需依賴標(biāo)準(zhǔn)品和標(biāo)準(zhǔn)曲線，對(duì)抑制物耐受程度高，尤其適用于未純化的病毒裂解樣品的定量檢測(cè)。
Fig1、重組腺相關(guān)病毒（rAAV）的生產(chǎn)
(1)將帶有目的基因序列的ITR 側(cè)翼表達(dá)載體質(zhì)粒與(2)攜帶rep-cap基因的AAV包裝質(zhì)粒和(3)腺病毒輔助質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK-293細(xì)胞時(shí)，AAV載體的生產(chǎn)效率與使用腺病毒感染時(shí)一致。
【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?/p>
我們利用Naica數(shù)字PCR技術(shù)對(duì)重組腺相關(guān)病毒(rAAV)質(zhì)粒載體和病毒基因組中ITR（CY5標(biāo)記）、EGFP（GOI，HEX標(biāo)記）和轉(zhuǎn)錄相關(guān)調(diào)控元件WPRE（FAM標(biāo)記）三個(gè)不同基因位點(diǎn)同時(shí)拷貝數(shù)定量的方法進(jìn)行優(yōu)化，在數(shù)據(jù)分析中對(duì)不同病毒樣品的前處理方案的條件進(jìn)行闡述和比較，發(fā)現(xiàn)病毒樣品的前處理方案中ITR發(fā)卡結(jié)構(gòu)的線性化和衣殼蛋白的裂解條件對(duì)病毒基因組拷貝數(shù)定量的精確性影響尤為重要，為數(shù)字PCR方法在基因治療病毒載體的質(zhì)量控制體系中建立標(biāo)準(zhǔn)的檢測(cè)方法提供依據(jù)。
【rAAV病毒基因組拷貝數(shù)滴度的定量檢測(cè)方案】
Fig2、cdPCR方法檢測(cè)rAAV基因組拷貝數(shù)滴度的流程示意圖
我們針對(duì)rAAV病毒載體進(jìn)行了三重靶基因同時(shí)檢測(cè)，包括：a. rAAV病毒通用檢測(cè)位點(diǎn)ITR基因（CY5標(biāo)記），b. EGFP（GOI）基因（HEX標(biāo)記）用于rAAV滴度定量檢測(cè)，c. 轉(zhuǎn)錄相關(guān)調(diào)控元件WPRE基因（FAM標(biāo)記），可用于協(xié)助EGFP（GOI）基因定量準(zhǔn)確性的評(píng)估。同時(shí)三重靶基因檢測(cè)對(duì)rAAV質(zhì)粒載體拷貝數(shù)定量、rAAV常用血清型rAAV2和rAAV8的病毒基因組拷貝數(shù)定量。
我們選用和元生物（OBiO）生產(chǎn)的rAAV2和rAAV8兩種血清型病毒樣品，在rAAV病毒樣品前處理階段，首先對(duì)rAAV2和rAAV8病毒顆粒進(jìn)行DNase I消化處理，然后使用不同的熱裂解條件對(duì)rAAV病毒衣殼蛋白進(jìn)行裂解，在使用兩種不同的稀釋液對(duì)rAAV病毒裂解樣品進(jìn)行梯度稀釋（Fig1），后續(xù)將梯度稀釋的待測(cè)樣品加入cdPCR反應(yīng)體系中，使用cdPCR系統(tǒng)進(jìn)行拷貝數(shù)定量（Fig2）。
由于rAAV病毒末端兩個(gè)ITR區(qū)域是反向互補(bǔ)序列，會(huì)形成發(fā)卡狀的二級(jí)結(jié)構(gòu)，影響引物和探針的結(jié)合，我們選擇使用Msp I限制性內(nèi)切酶處理。在已報(bào)道的檢測(cè)方法中，需要在數(shù)字PCR反應(yīng)前對(duì)病毒基因組進(jìn)行酶切預(yù)處理。由于cdPCR系統(tǒng)基于Crystal微滴技術(shù)即“微晶”微滴技術(shù)，允許直接添加限制性內(nèi)切酶混合于cdPCR反應(yīng)體系中，經(jīng)過微滴生成步驟即可完成酶切反應(yīng)，節(jié)省對(duì)病毒載體樣品的處理時(shí)間。
Fig3、cdPCR系統(tǒng)檢測(cè)流程
cdPCR采用創(chuàng)新型微流控設(shè)計(jì)的2D微滴矩陣技術(shù)即Crystal微滴技術(shù)作為整個(gè)系統(tǒng)的核心技術(shù)理念，Opal高通量芯片做為專用的耗材，可單一樣品生成和讀取約20000個(gè)微滴數(shù)，僅需一步法上樣將PCR預(yù)混液加入Opal芯片中即可完成從微滴生成、PCR擴(kuò)增和三色熒光分析的整個(gè)實(shí)驗(yàn)流程，全程僅需2個(gè)半小時(shí)。結(jié)合Crystal miner智能可視化的圖像分析軟件，獲得卓越的置信水平和真實(shí)可信的數(shù)據(jù)結(jié)果（Fig3）。
【結(jié)果】
cdPCR檢測(cè)質(zhì)粒樣品進(jìn)行概念驗(yàn)證
通過陽性對(duì)照質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行概念驗(yàn)證，測(cè)試三重引物和探針的使用性能，根據(jù)線性化質(zhì)粒定量檢測(cè)的結(jié)果顯示，WPRE（Fig4A）和EGFP (Fig4B)陰陽性微滴群的區(qū)分度良好，但是ITR(Fig4C) 陰陽性微滴群的區(qū)分度不好，存在雨滴現(xiàn)象，可能是受到ITR發(fā)卡狀二級(jí)結(jié)構(gòu)影響，隨后我們?cè)赾dPCR反應(yīng)體系中加入Msp I限制性內(nèi)切酶用于切割I(lǐng)TR發(fā)卡結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示酶切后陰陽性微滴群的區(qū)分度得到極大改善（Fig4D）。經(jīng)Msp I酶切后ITR拷貝數(shù)定量也比酶切前更接近于理論值（Fig5）。
Fig4、cdPCR檢測(cè)WPRE/EGFP/ITR 三靶標(biāo)1D散點(diǎn)圖
A圖顯示W(wǎng)PRE檢測(cè)的1D散點(diǎn)圖，B圖顯示EGFP檢測(cè)的1D散點(diǎn)圖，C圖顯示Msp I酶切處理前ITR檢測(cè)的1D散點(diǎn)圖，D圖顯示Msp I酶切處理后ITR檢測(cè)的1D散點(diǎn)圖，藍(lán)色表示W(wǎng)PRE陽性微滴群，綠色表示EGFP陽性微滴群，紅色表示ITR陽性微滴群，灰色表示陰性微滴群。
Fig5、Msp I酶切前后ITR基因絕對(duì)定量拷貝數(shù)值
上圖空心圓圈代表Msp I酶切前的數(shù)據(jù)；實(shí)心方塊代表Msp I酶切后的數(shù)據(jù)；橫線代表CI at 95%下的平均值mean。
接下來對(duì)梯度稀釋的線性化質(zhì)粒樣品進(jìn)行定量檢測(cè)，結(jié)果表明cdPCR定量結(jié)果和理論值一致性較高，三個(gè)靶基因測(cè)量R2均接近1（Fig6）。對(duì)于4個(gè)批次內(nèi)及批次間樣本檢測(cè)結(jié)果分析（表1），cdPCR定量數(shù)據(jù)均表現(xiàn)出良好的重復(fù)性，變異系數(shù)最大值小于5.46%。
Fig6、cdPCR檢測(cè)三個(gè)靶標(biāo)基因測(cè)量值和理論值的一致性
A圖顯示W(wǎng)PRE基因；B圖顯示EGFP基因；C圖顯示ITR基因。圖中豎線代表error bar。
表1 cdPCR對(duì)4個(gè)批次質(zhì)粒樣品的定量檢測(cè)結(jié)果的一致性分析
cdPCR測(cè)試不同稀釋液對(duì)病毒滴度的影響
分別使用稀釋液A和稀釋液B稀釋處理rAAV2和rAAV8病毒樣品，并進(jìn)行三梯度線性檢測(cè)EGFP（GOI）基因（Fig7），結(jié)果顯示兩種稀釋液的定量數(shù)據(jù)無明顯差異。
Fig7、不同稀釋液對(duì)rAAV EGFP基因定量檢測(cè)結(jié)果的影響
圖中黑色方塊代表稀釋液A，灰色方塊代表稀釋液B，橫線代表CI at 95%下的平均值（n=3）。
?cdPCR檢測(cè)不同的熱裂解時(shí)間對(duì)rAAV病毒基因組拷貝數(shù)定量的影響
為了探討rAAV病毒衣殼蛋白熱裂解時(shí)間對(duì)定量結(jié)果的影響，分別對(duì)rAAV2和rAAV8進(jìn)行10分鐘和20分鐘熱裂解處理并對(duì)定量數(shù)據(jù)進(jìn)行比較，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明rAAV2和rAAV8兩種病毒在10分鐘和20分鐘的條件下定量數(shù)據(jù)無顯著差異（Fig8）。
Fig8、分別熱裂解10分鐘和20分鐘對(duì)rAAV2和rAAV8病毒基因組拷貝數(shù)的定量數(shù)據(jù)
圖中顯示2和8分別代表rAAV2和rAAV8，其中圓點(diǎn)代表測(cè)得濃度，橫線代表均值。
rAAV病毒樣品 ITR與EGFP及WPRE的比值
ITR是位于rAAV病毒基因組兩側(cè)的短DNA 序列，當(dāng)使用Msp I限制性內(nèi)切酶切處理后，檢測(cè)出的ITR拷貝數(shù)和EGFP（GOI）及WPRE基因的比例應(yīng)該是2:1:1。在10分鐘和20分鐘熱裂解處理后，分別檢測(cè)rAAV2和rAAV8病毒樣品的三個(gè)濃度梯度，計(jì)算ITR/EGFP和ITR/WPRE的比值并進(jìn)行Bland-Altman一致性分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明rAAV2病毒樣品處理過程中采用熱裂解10分鐘得到的結(jié)果更接近于預(yù)期比值，對(duì)rAAV8病毒樣品的熱裂解時(shí)間20分鐘比值優(yōu)于10分鐘的比值。兩種病毒之間關(guān)鍵基因的比值差異推測(cè)可能是由于rAAV血清型差異導(dǎo)致的。
Fig9、Bland-Altamn分析不同熱裂解時(shí)間對(duì)rAAV2和rAAV8中ITR、EGFP和WPRE定量比率的一致性
最后對(duì)兩種病毒樣品分別進(jìn)行十倍梯度稀釋檢測(cè)（5個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)，每個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)重復(fù)3次）以驗(yàn)證cdPCR方法的靈敏度，同時(shí)可幫助評(píng)估LOQ定量檢測(cè)限，結(jié)果如下表9所示，兩種rAAV病毒樣品的三個(gè)靶基因定量檢測(cè)線性R2均接近1，對(duì)于低豐度樣品三個(gè)靶基因均有檢出。此外對(duì)低豐度樣品判定，可以借助Crystal Miner軟件的“Explore Crystal”功能對(duì)微滴進(jìn)行追溯分析，確保結(jié)果真實(shí)可靠（Fig10）。
表9：rAAV2和rAAV8梯度稀釋檢測(cè)
Fig10、Crystal Miner軟件進(jìn)行低豐度病毒樣品中陽性微滴進(jìn)行追溯分析
【總結(jié)】
cdPCR 進(jìn)行rAAV病毒基因組拷貝數(shù)的定量檢測(cè)具有更好的數(shù)據(jù)重復(fù)性和數(shù)據(jù)一致性，這一點(diǎn)對(duì)于rAAV基因組拷貝數(shù)定量以及成品的質(zhì)量控制是至關(guān)重要的。此外cdPCR系統(tǒng)具備智能可視化Crystal Miner分析軟件，可以進(jìn)行數(shù)據(jù)的質(zhì)控溯源分析，確保數(shù)據(jù)的精確性。本次實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)基于三熒光通道cdPCR系統(tǒng)首次在同一反應(yīng)中檢測(cè)三個(gè)rAAV病毒樣品中相關(guān)靶基因，對(duì)于三重?cái)?shù)字PCR實(shí)驗(yàn)中各熒光通道之間的串?dāng)_現(xiàn)象，能夠通過Crystal Miner分析軟件手動(dòng)或者自動(dòng)實(shí)現(xiàn)熒光串?dāng)_的補(bǔ)償校正，避免因熒光染料發(fā)射光譜之間疊加所造成的誤差導(dǎo)致結(jié)果的誤判（Fig13）。
Fig13、Crystal Miner軟件進(jìn)行熒光補(bǔ)償校正
A、熒光補(bǔ)償校正前，Blue通道和Green通道熒光圖譜；B、熒光補(bǔ)償校正調(diào)整前，Blue通道1D圖；C、熒光補(bǔ)償校正后，Blue通道和Green通道熒光圖譜；D、熒光補(bǔ)償校正后，Blue通道1D圖。在B和D中灰色代表陰性微滴群體，藍(lán)色代表陽性微滴群體。
最后我們探索出適合rAAV2和rAAV8病毒基因組拷貝數(shù)的定量檢測(cè)流程（Fig14），本次實(shí)驗(yàn)旨在為基因治療領(lǐng)域的科學(xué)家和研究學(xué)者提供一個(gè)參考依據(jù)，用于制定高效的rAAV病毒基因組拷貝數(shù)定量檢測(cè)的解決方案。
Fig14、rAAV2和rAAV8病毒基因組拷貝數(shù)的定量檢測(cè)流程
【參考文獻(xiàn)】
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【關(guān)于熙寧】
熙寧生物是一家專業(yè)的符合國際GLP&GCP質(zhì)量管理規(guī)范的生物藥生物分析實(shí)驗(yàn)室，為國內(nèi)外生物醫(yī)藥公司提供臨床和臨床前大分子生物分析(Bioanalysis，BA) 和伴隨診斷(Companion Diagnostics，CDx) 產(chǎn)品開發(fā)服務(wù)。
一站式的生物分析服務(wù)包括抗體制備和細(xì)胞株構(gòu)建，樣本采集包及實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，符合法規(guī)要求的分析方法學(xué)的開發(fā)和驗(yàn)證，以及樣本分析。檢測(cè)類型涵蓋藥代動(dòng)力學(xué)(PK)，藥效學(xué)(PD)，抗藥抗體(ADA)，中和抗體(NAb)，和生物標(biāo)志物(Biomarker)檢測(cè)，包括基于流式細(xì)胞術(shù)(FACS)和基因檢測(cè)平臺(tái)(PCR)針對(duì)細(xì)胞和基因治療藥物的PK, PD分析服務(wù)，以及細(xì)胞和基因水平的生物標(biāo)志物檢測(cè)、二代測(cè)序(NGS)服務(wù)。伴隨診斷產(chǎn)品開發(fā)服務(wù)包括LDT方法學(xué)開發(fā)、CDx產(chǎn)品開發(fā)及驗(yàn)證、注冊(cè)檢驗(yàn)、臨床試驗(yàn)研究和注冊(cè)申報(bào)。
【關(guān)于艾普拜】
艾普拜生物科技（蘇州）有限公司位于江蘇醫(yī)療器械科技產(chǎn)業(yè)園，已通過國家高新技術(shù)企業(yè)，擁有2500平米的生產(chǎn)廠房。艾普拜生物作為臨床分子檢測(cè)的一體化解決方案供應(yīng)商，致力于精準(zhǔn)醫(yī)療診斷產(chǎn)品（診斷試劑、儀器）的研發(fā)、生產(chǎn)、銷售和服務(wù)。公司基于先進(jìn)的Naica CN數(shù)字PCR平臺(tái)和自主專利的檢測(cè)技術(shù)，持續(xù)開發(fā)以游離DNA作為檢測(cè)材料的用于疾病診斷和治療的基因檢測(cè)項(xiàng)目和試劑盒，主要應(yīng)用于與疾病相關(guān)分子及細(xì)胞遺傳學(xué)檢驗(yàn)、靶向用藥指導(dǎo)的分子診斷檢測(cè)等數(shù)十種臨床檢測(cè)產(chǎn)品，操作簡(jiǎn)便、結(jié)果迅速、分析簡(jiǎn)單，靈敏度高。
公司在檢測(cè)儀器和試劑方面擁有多項(xiàng)核心技術(shù)，已獲得國內(nèi)外專利授權(quán)十余項(xiàng)，軟件著作權(quán)多項(xiàng)。公司通過ISO9001、ISO13485等認(rèn)證，具有完備的質(zhì)量管理體系，繼公司數(shù)字PCR系統(tǒng)于2021年3月獲得醫(yī)療器械注冊(cè)證后，實(shí)時(shí)熒光PCR分析儀同時(shí)獲批醫(yī)療器械注冊(cè)證。
