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1.PROTAC概念介紹
PROTAC (Proteolysis Targeting Chimeras，蛋白降解靶向聯(lián)合體) 是一種利用泛素－蛋白酶體系統(tǒng)（Ubiquitin-Proteasome System, UPS）對靶蛋白進(jìn)行降解的藥物開發(fā)技術(shù)（圖1A）。PROTAC是一種異雙功能分子，由結(jié)合靶蛋白（Protein of Interest，POI）的配體通過“Linker”連接到E3泛素連接酶的配體組成。該分子促進(jìn)靶蛋白、PROTAC和E3連接酶的三元復(fù)合物形成，并使靶蛋白泛素化，隨后，泛素化的POI被真核細(xì)胞中的內(nèi)源性26s蛋白酶體識別和降解。例如，PROTAC分子ARV-825是由結(jié)合POI的配體、招募 E3 連接酶的配體和連接兩個區(qū)域的Linker制成的異雙功能降解劑，可以靶向降解BRD4（圖1B）。
圖1：A. PROTAC降解靶蛋白示意圖；B. 降解劑ARV-825的結(jié)構(gòu)及其作用機制
2.PROTAC研發(fā)現(xiàn)狀
2001年，Crews小組報導(dǎo)了第一個PROTAC分子。近20年來，特別是2015年以來，PROTAC 領(lǐng)域進(jìn)入了快速發(fā)展期。迄今為止，已經(jīng)公開了多種基于不同 E3 連接酶和蛋白質(zhì)配體的 PROTAC降解劑，可以降解不同類型的靶蛋白。6月9日，清華大學(xué)藥學(xué)院饒燏團(tuán)隊在Signal Transduction and Targeted Therapy 雜志上發(fā)表了一篇綜述論文，其中提到，2020-2021年新增了約90個可被PROTAC降解的蛋白質(zhì)靶標(biāo)，這遠(yuǎn)超此前18年的總量（40多個），這表明——蛋白質(zhì)降解時代已經(jīng)到來。
由于其獨特的作用機制，PROTAC已被開發(fā)用于癌癥、免疫相關(guān)疾病、病毒感染、神經(jīng)退行性疾病等疾病的治療，多款項目已經(jīng)進(jìn)入臨床開發(fā)階段。截止2022年3月，全球約有十幾個PROTAC進(jìn)入臨床開發(fā)階段，處于臨床前的項目還有110個左右。目前，PROTAC 藥物在全球暫無相關(guān)產(chǎn)品獲批，進(jìn)展最快的四個國際大型藥企為Arvinas、Kymera、C4 Therapeutics（簡稱“C4T”）、Nurix。其中，Arvinas公司的ARV-110、ARV-471已進(jìn)入臨床Ⅱ期。同時，一些國內(nèi)新藥公司管線也有產(chǎn)品推進(jìn)到臨床Ⅰ/Ⅱ期，出現(xiàn)在國際最前沿，包括百濟(jì)神州、開拓藥業(yè)、海創(chuàng)藥業(yè)、海思科、珃諾生物等。
表1：全球臨床和IND階段基于PROTAC技術(shù)的蛋白質(zhì)降解候選藥物
3.PROTAC的優(yōu)勢
（1）不依賴“占位驅(qū)動”
從作用模式（Mode of Action，MOA）來看，傳統(tǒng)的小分子和抗體藥物都是需要抑制劑或單抗具備較高的濃度來占據(jù)靶點的活性位點，從而阻斷下游信號通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)來發(fā)揮治療疾病的作用，這種作用模式稱為“占位驅(qū)動”。而PROTAC是“事件驅(qū)動”，只要產(chǎn)生結(jié)合作用就可以誘導(dǎo)相關(guān)靶蛋白的降解。
（2）可靶向“不可成藥”靶點
大多數(shù)小分子藥物或單抗需要結(jié)合酶或受體的活性位點來發(fā)揮作用，然而，據(jù)估計，人類細(xì)胞中80%的蛋白缺乏這樣的位點。相比之下，PROTAC可以結(jié)合于靶蛋白表面的任何結(jié)合位點，更容易開發(fā)簡單有效和選擇性高的配體，作用于一些傳統(tǒng)意義上不可成藥的靶點。通過PROTAC技術(shù)靶向這些“不可成藥”靶點蛋白可能會使靶點從“不可成藥性”變成“可成藥性”，將在疾病治療中帶來前所未有的突破。
（3）提高選擇性
與傳統(tǒng)小分子抑制劑相比，利用小分子抑制劑設(shè)計開發(fā)的PROTAC在某些靶點上可實現(xiàn)更好的選擇性。當(dāng)非選擇性抑制劑作為POI 配體合成PROTAC時，不僅POI配體可以識別相應(yīng)的目標(biāo)蛋白，而且可以誘導(dǎo) POI 和 E3 連接酶之間特定的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用形成三元復(fù)合物。PROTAC分子對靶點蛋白的選擇性可以理解為：一旦PROTAC和E3連接酶復(fù)合體形成二元復(fù)合體，對目標(biāo)蛋白的結(jié)合位點附近的立體結(jié)構(gòu)、凹槽深度、Linker旋轉(zhuǎn)自由度等有了更高的要求，從而減少了可靶向降解的目標(biāo)蛋白。
（4）催化劑量、低頻次
PROTAC分子降解靶蛋白后能被循環(huán)利用，因此催化劑量即可產(chǎn)生很好的藥理活性。秦沖等人發(fā)現(xiàn)的靶向降解（bromodomain and extra-terminal）BET蛋白的QCA570在細(xì)胞抗增殖活性方面表現(xiàn)出了明顯優(yōu)于BET 抑制劑JQ1等抑制劑的能力，達(dá)到了皮摩爾級水平。此外，PROTAC引發(fā)靶蛋白降解后，能夠從復(fù)合物中解離，并進(jìn)入下一個催化循環(huán)。一旦先前存在的蛋白耗盡，PROTAC只需要降解重新合成的靶蛋白，而大多數(shù)蛋白質(zhì)的再合成速度很慢。因此使用PROTAC可以延長藥物作用時間，減少用藥頻次。
（5）延長作用時間
靶蛋白的降解是時間依賴性的，PROTAC可以在幾分鐘內(nèi)將細(xì)胞內(nèi)靶蛋白消耗到接近基礎(chǔ)水平。即使在PROTAC完全清除后，細(xì)胞可能仍需要一段相當(dāng)長的時間，才能將蛋白質(zhì)庫恢復(fù)生理信號的水平，從而大大延長作用時間。
（6）克服藥物耐用性
盡管臨床上應(yīng)用了多種治療方法，但小分子抑制劑或拮抗劑在臨床用藥過程中，不可避免的都會發(fā)生獲得性耐藥。此外，目前對靶標(biāo)的探索的重點是它們的酶促功能，而忽略了它們的支架部分的功能。與其事件驅(qū)動的藥理學(xué)一致，PROTAC對目標(biāo)蛋白的催化去除和整體降解是由結(jié)合靶蛋白而不是功能破壞驅(qū)動，非常適合治療許多臨床相關(guān)的、靶向治療誘導(dǎo)的耐藥機制。 這包括 1) 藥物結(jié)合點突變而受損；2) 突變導(dǎo)致靶點組成激活；3) 突變誘導(dǎo)結(jié)合域構(gòu)象變化；4) 通過靶點復(fù)合物重排獲得支架功能；5) 靶蛋白過表達(dá)；；6) 競爭加劇來自內(nèi)源性配體；7) 剪接突變。 PROTAC 可以基于中性結(jié)合劑構(gòu)建，該結(jié)合劑可以結(jié)合靶蛋白的任何位置，這為解決突變變異開辟了新的機會。因此，在突變導(dǎo)致現(xiàn)有配體的結(jié)合親和力完全喪失或結(jié)合位點喪失的情況下，可能會被用于開發(fā)新的 PROTAC結(jié)合劑。
4.PROTAC靶點選擇與設(shè)計
目前文獻(xiàn)報導(dǎo)的PROTAC可靶向降解不同類型的蛋白質(zhì)，包括核受體（ER 和 AR等）、激酶 (Akt、BCR-ABL、c-ABL、BTK等)、轉(zhuǎn)錄因子 (Sirt2、HDAC6、TRIM24)、BET 溴結(jié)構(gòu)域（BET蛋白）等。選擇合適的目標(biāo)蛋白配體，是PROTAC分子可以降解靶蛋白的關(guān)鍵，主要包括天然產(chǎn)物、酶抑制劑以及多肽。Linker其實沒有一個特定的設(shè)計規(guī)律，主要有PEG，烷基，炔基，三唑環(huán)，哌嗪和哌啶等等，像ARV-110和ARV-471都是結(jié)合了哌嗪和哌啶設(shè)計的。人類基因組可以編碼600多個E3泛素連接酶，目前在PROTAC設(shè)計中僅使用了少數(shù)E3連接酶，包括Von Hippel-Lindau（VHL）、cereblon（CRBN）、the mouse double minute 2 homologue (MDM2)等。效果較好、使用頻次最高的E3連接酶主要是CRBN和VHL兩種。其中，CRBN的配體主要是來那度胺、泊馬度胺及其類似物，VHL的配體主要是VHL-L，各部分分類如圖2所示。
圖2：PROTAC靶點、配體、連接子、E3泛素連接酶類別
5.PROTAC的藥物代謝和藥代動力學(xué)（DMPK）挑戰(zhàn)
盡管PROTAC 具有良好的藥效潛力，但是其雙功能性質(zhì)可能會導(dǎo)致物理化學(xué)特性，與傳統(tǒng)小分子藥物相比，專注于開發(fā)口服生物利用度降解劑的藥物將面臨復(fù)雜的藥物代謝和藥代動力學(xué)（DMPK）挑戰(zhàn)。它們的主要物理化學(xué)特征通常包括高分子量（700 ~ 1200 Da）、高極性表面積、大量可旋轉(zhuǎn)鍵以及較差的溶解性和滲透性。
（1）監(jiān)管機構(gòu)（美國FDA或ICH）沒有針對特定DMPK挑戰(zhàn)的具體指導(dǎo)。實際上，小分子藥物的指導(dǎo)通常是根據(jù)具體情況提及的，但PROTAC與傳統(tǒng)的小分子有顯著不同。
（2）PROTAC的獨特結(jié)構(gòu)使得很難符合Lipinski為小分子設(shè)計的五個規(guī)則。這些藥物的分子量通常落在700~1000 Da范圍內(nèi)，溶解度差。但符合Lipinski的親脂性，氫鍵供體或受體和極地表面積的其他規(guī)則。
（3）PROTAC藥物的滲透性較差，導(dǎo)致口服藥物的藥物能力差，并且體外和體內(nèi)滲透性之間的相關(guān)性較弱。同樣，小分子的體外通透性評估系統(tǒng)通常不適合PROTAC。
（4）PROTAC藥物已顯示出“hook” 效應(yīng)（即，PROTAC在較大濃度的時候優(yōu)先形成的是POI-PROTAC和E3-PROTAC兩種二元復(fù)合物，影響三元復(fù)合物的形成，從而降低了療效或有毒反應(yīng)）。這要求藥物研究界更清楚地了解PROTAC藥物的PK/PD特征和適當(dāng)?shù)膭┝糠秶?/p>
（5）PROTAC的代謝產(chǎn)物，尤其是“l(fā)inker”切割代謝物，可能會競爭結(jié)合靶標(biāo)或E3連接酶。與“hook” 效應(yīng)相似，這種結(jié)合可降低功效。因此，代謝物的分析和鑒定是其臨床前篩查的關(guān)鍵部分，這不僅對于選擇適當(dāng)?shù)亩纠韺W(xué)物種，而且對于理解劑量反應(yīng)關(guān)系而言至關(guān)重要。
最近，Dr. Liping Ma提出了七個提高PROTACs口服生物利用度的策略：1）與食物一起服用；2）通過更改linker長度，更改鏈接器的錨點，使用循環(huán)鏈接器以及更改接頭的附件站點，以提高代謝穩(wěn)定性PROTAC分子的代謝穩(wěn)定性；3）優(yōu)化linker 結(jié)構(gòu)改善細(xì)胞滲透性；4）選擇更小的E3連接酶配體；5）在PROTAC結(jié)構(gòu)設(shè)計中引入分子內(nèi)氫鍵從而降低分子大小和極性來促進(jìn)細(xì)胞的滲透性；6）通過修飾藥理學(xué)活性化合物獲得前藥；7）使用其他蛋白降解劑比如分子膠代替PROTAC。
6.PROTAC生物分析
由于PROTAC分子結(jié)構(gòu)和作用的機理，在生物分析中需要中需重點考察穩(wěn)定性?？赏ㄟ^向樣品中加入酶抑制劑或者低溫處理樣品來提高穩(wěn)定性。此外在方法開發(fā)中發(fā)現(xiàn)，可能由于其親脂性，有些PROTAC藥物存在一定的非特異性吸附，因此在PROTAC生物分析中需要關(guān)注該問題。如圖3所示，PROTAC藥物定量下限為1.00 ng/mL，通過蛋白沉淀進(jìn)行樣品前處，從結(jié)果看，不管是干擾、靈敏度以及線性關(guān)系都是完全能滿足臨床樣品的檢測需求。此外本實驗還進(jìn)行了穩(wěn)定性考察，如表2所示，不進(jìn)行任何干預(yù)的情況下在實驗臺放置12小時樣品降解超過20.0%，進(jìn)行一定的干預(yù)措施后樣品能夠在實驗臺維持至少10個小時，因此該條件能完全保證樣品采集和前處理過程中樣品的穩(wěn)定性。
A
B
C
圖3：A. 空白樣品圖譜；B. 定量下限圖譜；C. 標(biāo)準(zhǔn)曲線圖
表2：短期穩(wěn)定性數(shù)據(jù)表
7.結(jié)束
熙寧生物質(zhì)譜平臺能夠提供符合NMPA/FDA/OECD/EMA的各項生物樣品分析服務(wù)，支持小分子藥物、多肽、寡核苷酸、PROTAC、ADC以及大分子抗體等藥物的方法開發(fā)、驗證和樣品檢測。平臺配備了多套高端液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)和Watson LIMS在內(nèi)的生物分析系統(tǒng)和軟件系統(tǒng)，各種先進(jìn)輔助設(shè)備，不僅可以滿足各型實驗的檢測需求，還大大提高實驗效率和質(zhì)量。 我們能夠更快、更好的為客戶提供專業(yè)的技術(shù)服務(wù)，更高效地幫助客戶完成藥品研發(fā)。
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