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前言
治療性蛋白藥物進(jìn)入機(jī)體后，通常會(huì)誘導(dǎo)免疫反應(yīng)的發(fā)生。對(duì)于大多數(shù)藥物，不良免疫反應(yīng)一般由體液免疫機(jī)制介導(dǎo)的免疫應(yīng)答所致，因此抗藥抗體（ADA）一直是定義該類(lèi)藥物免疫原性的主要標(biāo)準(zhǔn)。ADA可能通過(guò)影響治療性蛋白與其靶點(diǎn)之間的藥效學(xué)作用或改變其藥代動(dòng)力學(xué)特征而影響藥效，某些情況下還可能引起嚴(yán)重的不良反應(yīng)甚至危及患者生命。因此，生物分析方法必須具有足夠的靈敏度和高度的特異性，以準(zhǔn)確檢測(cè)和表征 ADA。電化學(xué)發(fā)光橋連免疫分析法是檢測(cè)ADA常用的方法之一，其靈敏度好，不受種屬限制，可檢測(cè)所有亞類(lèi)ADA和除IgG4外大部分亞型，因此被廣泛應(yīng)用。然而，橋連法容易受到幾種干擾分子的影響，如循環(huán)中的游離藥物、藥物靶點(diǎn)或血清中存在的其他因子（如類(lèi)風(fēng)濕因子）。正如高水平的藥物會(huì)干擾 ADA 檢測(cè)一樣，當(dāng)樣本中的藥物靶點(diǎn)以足夠高的濃度存在時(shí)，也可能影響 ADA 信號(hào)，并可能干擾臨床相關(guān) ADA 的檢測(cè)。常見(jiàn)的影響ADA檢測(cè)的可溶性靶點(diǎn)分子包括：IgE，生長(zhǎng)因子如血管生成素、神經(jīng)生長(zhǎng)因子和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子，細(xì)胞因子如腫瘤壞死因子α、白細(xì)胞介素5，糖基化可溶性靶點(diǎn)和脫落的細(xì)胞膜蛋白等。靶點(diǎn)干擾可能會(huì)引起假陽(yáng)性或假陰性，當(dāng)可溶性靶點(diǎn)以可溶性二聚體或多聚體形式存在時(shí)，其可與捕獲試劑和檢測(cè)試劑橋連而產(chǎn)生假陽(yáng)性信號(hào)；若可溶性單體靶點(diǎn)以足夠高的濃度存在時(shí)，可與ADA競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合捕獲試劑導(dǎo)致假陰性結(jié)果。由于藥物對(duì)靶點(diǎn)的高度特異性以及每種靶點(diǎn)蛋白的高度可變的生物學(xué)特性，因此來(lái)自可溶性靶點(diǎn)的干擾是最難克服的。
可溶性靶點(diǎn)受體和輔因子蛋白的組合降低了猴血清樣品中靶點(diǎn)介導(dǎo)的信號(hào)
作為靶點(diǎn)的天然結(jié)合伴侶，受體對(duì)靶點(diǎn)具有高親和力，可與藥物競(jìng)爭(zhēng)靶點(diǎn)結(jié)合，從而有效緩解靶點(diǎn)干擾。可溶性靶點(diǎn)受體能夠以劑量依賴性方式減輕靶點(diǎn)介導(dǎo)的信號(hào)（圖 1A）。在 100 μg/mL 時(shí)，可溶性靶點(diǎn)受體有效阻斷了猴血清樣品中的靶點(diǎn)干擾（圖 1A）。在體內(nèi)，在許多情況下，受體蛋白與輔因子蛋白密切相關(guān)，輔因子蛋白有助于維持受體結(jié)構(gòu)并提高其結(jié)合靶點(diǎn)的能力。將不同濃度的輔因子蛋白添加到 50 μg/mL 的可溶性靶受體中時(shí)，可進(jìn)一步降低猴血清樣品中的背景信號(hào)，當(dāng)受體和輔因子濃度均為50 μg/mL時(shí)，降低靶點(diǎn)干擾的效果最為顯著（圖 1B）。在一組猴血清樣本中，可溶性受體和輔因子蛋白的組合有效地抑制了靶點(diǎn)介導(dǎo)的假陽(yáng)性信號(hào)（圖 1C）。 除了一個(gè)樣品（S1）的平均信號(hào)值仍有約350，其他所有樣品的平均信號(hào)值都大大降低。雖然樣品S1信號(hào)值高于其他測(cè)試樣品，但添加可溶性受體及其輔因子仍然抑制了大約 80% 的信號(hào)。
Figure 1
Figure 1. The combination of the soluble receptor and co-factor proteins can mitigate target-mediated signal in monkey naive serum samples. (A) Soluble target receptor can also inhibit target-mediated signal in a naive monkey serum sample in a dose-dependent manner. (B) The soluble receptor and co-factor molecules functioned synergistically in inhibiting the target-mediated signal, with the combination of 50 μg/mL of the receptor and 50 μg/mL of the co-factor being the most effective. (C) Target-mediated signal in eight monkey naive samples can be inhibited by the combination of the soluble receptor (50 μg/mL) and the co-factor (50 μg/mL).
弱酸條件下可以抑制猴血清樣品中的靶點(diǎn)干擾，提高靶點(diǎn)耐受水平
與中性 pH 條件相比，在酸性條件下（pH ～ 6.0），藥物REGN-Y與其靶點(diǎn)的結(jié)合親和力大大降低（表 2）。為了測(cè)試弱酸性條件下是否也能抑制 ADA 檢測(cè)中靶點(diǎn)介導(dǎo)的信號(hào)，在存在或不存在靶受體和輔因子及中性或弱酸性（pH ～6.0）條件下，測(cè)試了四個(gè)猴血清樣品。僅使用弱酸條件以及在中性pH條件下加入受體和輔助因子只能部分抑制猴血清樣品的高背景信號(hào)值（圖 2A）。只有在弱酸條件下（pH ～6.0）加入靶點(diǎn)受體和輔助因子才能完全抑制靶點(diǎn)介導(dǎo)的信號(hào)（圖 2A）。此外，弱酸性條件（pH ～6.0）與靶受體/輔因子的組合也大大提高了靶點(diǎn)耐受水平（圖 2B）。中性條件下，加入靶受體和輔因子，靶點(diǎn)耐受水平約為94 ng/mL， pH =6.5條件下，加入靶受體和輔因子，靶點(diǎn)耐受水平提高至約為380 ng/mL，當(dāng)pH =6時(shí)，加入靶受體和輔因子，靶點(diǎn)耐受水平提高至5.0 μg / mL以上（圖2B）。以上結(jié)果說(shuō)明弱酸性的pH值有助于減輕靶點(diǎn)介導(dǎo)的信號(hào)。為了驗(yàn)證弱酸條件是否會(huì)干擾真實(shí)ADA的檢測(cè)，在不同pH值條件下對(duì)ADA陽(yáng)性兔血清樣本進(jìn)行分析。如圖3所示，無(wú)論試驗(yàn)pH值如何，ADA 平均信號(hào)值都是相似的，這表明在這些樣本中，弱酸性pH對(duì)ADA陽(yáng)性反應(yīng)的檢測(cè)影響很小，甚至沒(méi)有影響。
Table2
Figure 2
Figure 2. Mild acidic assay pH can help mitigate the target interference. (A) Both mild acidic assay pH alone (pH ～6.0) and the combination of the soluble receptor (50 μg/mL) and co-factor (50 μg/mL) can partially inhibit target-mediated signal in four naive monkey serum samples (individual bars). The best inhibition was obtained with the combination of the soluble receptor (50 μg/mL), co-factor (50 μg/mL) and mild acidic assay pH (pH ～6.0). (B) Target tolerance levels, measured using a serum sample spiked with the recombinant target protein, improved with acidic assay pH in the presence of 50 μg/mL of both the soluble receptor and co-factor.
Figure 3
Figure 3. Mild acidic assay pH has minimal impact on true anti-drug antibody detection. A similar polyclonal anti-REGN-Y anti-drug antibody signal was detected in an early rabbit bleed (～30 days after immunization) regardless of assay pHs, indicating the mild acidic assay pH has minimal impact on the stability and/or the detection of a true anti-drug antibody response.
Figure 4
Figure 4. Schematic representation of the target interference mitigation strategy employed. (A) In the absence of the soluble receptor and co-factor, under neutral assay pH, the multimeric target protein will bind to both Bio-REGN-Y and Ru-REGN-Y and generate target-mediated signal. (B) In the presence of the receptor and co-factor, under a mild acidic assay pH, the target can no longer bridge the labeled drugs due to two different but synergistic effects. First, the acidic pH reduces the ability of labeled drugs to bind to any available target. Second, the receptor and co-factor sequester the target so it will not re-associate with the labeled drugs.
總結(jié)
除了使用靶點(diǎn)特異性封閉試劑外，改變檢測(cè) pH 值也可以在消除靶點(diǎn)干擾方面發(fā)揮重要作用。通過(guò)改變Asssay的pH值可直接影響二聚體或多聚體靶蛋白或改變藥物與靶點(diǎn)的結(jié)合親和力以減輕靶點(diǎn)干擾。在本文這項(xiàng)研究中，弱酸條件下可以部分抑制靶點(diǎn)介導(dǎo)的信號(hào)，這可能是在弱酸性條件下，藥物與靶點(diǎn)的結(jié)合親和力降低，一定程度上抑制了標(biāo)記藥物與靶點(diǎn)的結(jié)合。而在之前的一項(xiàng)研究中，弱堿性條件下也可以通過(guò)限制靶點(diǎn)與藥物的結(jié)合和促進(jìn)靶點(diǎn)-藥物復(fù)合物的解離來(lái)幫助減輕二聚體靶點(diǎn)干擾。不同的 pH 條件可用于破壞或增強(qiáng)這些靶點(diǎn)封閉試劑、藥物、ADA、藥物靶點(diǎn)和標(biāo)記的藥物分子之間的各種相互作用，因此，要設(shè)計(jì)這種基于 pH 的Assay，需要仔細(xì)評(píng)估每個(gè)單獨(dú)的 ADA 檢測(cè)的特定pH 條件，了解靶蛋白的生物學(xué)特性以及不同 pH 條件下的靶點(diǎn)與藥物相互作用，以確保選擇合適的測(cè)定條件以減輕靶點(diǎn)干擾且不會(huì)干擾真實(shí)ADA的檢測(cè)。
盡管使用可溶性靶點(diǎn)受體可以非常有效地抑制靶點(diǎn)干擾，但仍有一些潛在的問(wèn)題需要考慮。如受體制備技術(shù)有限，體外無(wú)法生產(chǎn)出和天然受體完全相同的重組受體，導(dǎo)致無(wú)法和可溶性靶點(diǎn)有效結(jié)合；藥物與靶點(diǎn)親和力極高，靶點(diǎn)很難與低親和力的受體結(jié)合。由于樣品中的天然靶點(diǎn)蛋白可能與重組版本不同，因此有必要測(cè)試實(shí)際給藥后樣品來(lái)評(píng)估靶點(diǎn)緩解策略的有效性。由于給藥后靶點(diǎn)受體從細(xì)胞膜脫離水平增加、內(nèi)在負(fù)反饋機(jī)制導(dǎo)致可溶性靶點(diǎn)分子分泌增多、靶點(diǎn)分子與藥物結(jié)合導(dǎo)致清除減慢等原因，給藥后樣品中的靶點(diǎn)水平可以增加到相當(dāng)高的水平，因此，為了確保在存在較高靶點(diǎn)濃度的情況下減輕靶點(diǎn)干擾，通常需要使用過(guò)量的靶封閉試劑。因此，需要考慮是否能生產(chǎn)足夠的可溶性靶點(diǎn)受體以支持大型臨床研究的需求，并結(jié)合受體的生產(chǎn)成本進(jìn)行考慮使用該法的必要性。
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