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前言
補體系統(tǒng)是天然免疫的重要部分，在病原體免疫監(jiān)測和維持組織穩(wěn)態(tài)中起著重要作用。補體系統(tǒng)識別免疫復合物、受損細胞或病原微生物的分子信號，繼而觸發(fā)蛋白水解級聯反應。該級聯反應由三條途徑組成，分別稱為經典途徑、凝集素途徑和替代途徑（CP、LP和AP）。補體系統(tǒng)的過量激活或者失調可能導致一系列的疾病發(fā)生。 隨著Alexion研發(fā)的首款C5補體抑制劑Sorilis以及后續(xù)長效的C5補體抑制劑Ultomiris的成功，Apellis研發(fā)的首款C3補體抑制劑Empavel成功上市，補體系統(tǒng)的藥物研發(fā)成為越來越熱的賽道。本文簡單盤點下目前補體系統(tǒng)藥物研發(fā)的熱門靶點，從臨床前和臨床階段藥效學分析方法的角度介紹下基于人血清/紅細胞裂解的補體功能藥效學測定旁路途徑檢測分析。
補體抑制劑藥物研發(fā)進展
針對補體系統(tǒng)的過量激活開發(fā)了大量的補體信號通路關鍵分子的抑制劑，目前走在前列的是靶向C5,C3,C1S等抑制劑已成功上市，適應癥主要集中在PNH, aHUS, myasthenia gravis等領域，同時隨著新藥研發(fā)的進程，在一期二期臨床階段，靶向FactorB，FactorD, MASP2補體系統(tǒng)新型抑制劑也在快速推進，部分補體系統(tǒng)的藥物研發(fā)見圖1，補體藥物正當時。
圖1：補體抑制劑的研發(fā)進展
補體抑制劑作用機理和藥效學分析方法
如圖2所示，補體系統(tǒng)的激活主要由三條路徑組成：
圖2：補體系統(tǒng)的三條激活路徑
1. 經典途徑（CP）：
經典途徑需要機體的抗體（通常為IgM，或者多聚化的IgG）和特定的抗原形成復合物后啟動，首先被補體系統(tǒng)中的識別單位：包括C1q、C1r、C1s識別；然后通過活化單位：包括C2、C3、C4形成級聯反應，最后由膜攻擊單位：包括C5、C6、C7、C8和C9，通過蛋白水解酶的作用形成復核物結合到細胞膜，使細胞膜損傷破碎。
2. 凝集素途徑 (LP)：
凝集素途徑由機體的甘露聚糖結合凝集素（mannan-binding lectin,MBL）或纖維膠凝蛋白（ficolin，FCN）直接識別多種病原微生物表面的甘露糖、N-乙酰甘露糖、N-乙酰葡萄糖氨、巖藻糖等為末端糖基的糖結構。MBL-MASP復合物與病原體表面糖結構結合，使MASP-1、MASP-2被獨立地激活?；罨腗ASP2發(fā)揮其活性，裂解C4，所產生的C4b片段共價結合于病原體表面，通過與C2相互作用，使后者也被MASP2裂解，形成C3轉化酶C4b2a，繼之活化補體CP；活化的MASP1能直接裂解C3產生C3b，在fD和fP的作用下，形成C3轉化酶C3bBb或C3bBbP，并產生C5轉化酶C3bBb3b，激活補體AP。
3. 旁路途徑 （AP）:
旁路途徑在正常生理情況下，機體的C3與B因子、D因子等相互作用，可緩慢的產生極少量的C3B和C3bBb（旁路途徑的C3轉化酶），但迅速受H因子和I因子的作用，不再能激活C3和后續(xù)的補體成分。
旁路途徑的激活在于激活物質（例如細菌脂多糖、肽聚糖；病素感染細胞、腫瘤細胞，痢疾阿米巴原蟲等）的出現。激活物質的存在為C3b或C3bBb提供不易受H因子置換Bb，不受Ⅰ因子滅活C3b的一種保護性微環(huán)境，使旁路激活途徑從和緩進行的準備階段過渡到正式激活的階段。
當C3被激活物質激活時，其裂解產物C3b又可在B因子和D因子的參與作用下合成新的C3bBb。后者又進一步使C3裂解。由于血漿中有豐富的C3，又有足夠的B因子和Mg2 ，因此這一過程一旦被觸發(fā)。就可能激活的產生顯著的擴大效應。有人稱此為依賴C3Bb的正反饋途徑，或稱C3b的正反饋途徑，激活效應將持續(xù)擴大。
在進行補體系統(tǒng)的新藥研發(fā)過程中，針對不同的藥物靶點，因處于補體激活信號通路的不同位置，甚至其靶向的補體路徑不一樣，需要采用不同的補體激活藥效血評估方法進行評估，這需要基于藥物的作用機理和補體激活路徑的充分了解下進行選擇；同時由于補體激活的三條激活路徑在活化和膜攻擊進程中會共用部分信號分子，檢測方法的特異性需要進行充分的評估。
C3抑制劑Empaveli的臨床藥效學分析方法解析
上市藥物Empaveli的藥物作用機理如圖3靶向補體蛋白C3，阻斷C3進一步活化，從而抑制補體信號通路的激活。由于C3蛋白的活化是經典路徑，凝集素路徑和旁路途徑共有，Empaveli可以同時抑制三條補體激活信號通路，跟三條信號通路相關的活性分析方法均能夠表征其藥效。
圖3：Empaveli的藥物作用機理
從Empaveli披露的文獻信息，其藥效學檢測分析方法只要進行了C3活性，CH50和AP50的檢測。
從Empaveli公布臨床前前的藥效學數據來看主要的依據是旁路途徑的溶血試驗抑制效果。
圖4：Empaveli臨床藥效學數據
臨床階段的旁路途徑的溶血試驗的難點分析：
1. 旁路途徑溶血試驗相對于經典途徑溶血試驗，沒有加特異性的抗體形成復核物激活C1q，溶血的效果相對較差，方法的區(qū)分度會較差。
2. 旁路途徑溶血試驗沒有標準品進行檢測體系變化的校準，采用不同來源，不同批次的sheep紅細胞，樣品血清的檢測溶血結果可能會有差異。
3. 不同個體旁路途徑的活性不一樣，藥物引起的效果將不太一樣，個體差異較大?？赡軙霈F低活性個體沒有藥效的情況。（如圖4，個別健康個體用藥后，藥物對個體的旁路補體活性無顯著性影響）
4. 旁路途徑為無標準品的非定量實驗，不同分析批的結果可能會有比較大的差異，在進行臨床用藥前和用藥后的樣品進行旁路活性比較時，分析批間的差異將會較大的影響的結果。
5. 旁路途徑溶血試驗的特異性需要得到證明，以避免經典途徑和凝集素途徑的干擾
熙寧生物的補體系統(tǒng)臨床前和臨床藥效學分析服務
熙寧生物有豐富的臨床階段基于人血清樣品進行補體信號通路藥效學評估的方法開發(fā)，驗證和樣品分析的經驗。可提供補體激活信號通路中經典途徑，凝集素途徑和旁路途徑的藥效學分析服務，部分藥效學分析結果如下：
如上圖人血清中的補體功能有顯著性的個體差異，在進行藥效學檢測數據分析時需基于個體的補體功能，對藥物的效果和離群值進行有效的區(qū)分。
基于人血清的補體信號通路藥效學評估模型可對藥物首次人體用藥的劑量進行外推和預測，是臨床前轉化醫(yī)學研究到臨床階段早期藥效評估的重要橋梁。
