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一、體液免疫原性中和抗體檢測(cè)方法構(gòu)架
體液免疫包含結(jié)合抗體和中和抗體檢測(cè)，相對(duì)于結(jié)合抗體檢測(cè)，中和抗體更加具備生理學(xué)意義，由于中和抗體檢測(cè)涉及到病毒，細(xì)胞等關(guān)鍵事件其方法學(xué)開發(fā)，驗(yàn)證和數(shù)據(jù)解讀也會(huì)變得比較復(fù)雜。
mRNA感染性疫苗，AAV Based藥物和溶瘤病毒，均可采用中和抗體檢測(cè)方法進(jìn)行體液免疫原性評(píng)估，且有著類似的技術(shù)路徑。臨床生物分析實(shí)踐過(guò)程中，通常會(huì)采用表達(dá)CMV-Luc的假病毒用來(lái)模擬基因治療藥物的病毒載體或者真實(shí)病毒，假病毒和被模擬替代的病毒有類似的衣殼蛋白或者關(guān)鍵侵染細(xì)胞的蛋白。將假病毒和待測(cè)血清樣品孵育，加入靶細(xì)胞中，如果假病毒能夠感染細(xì)胞，將會(huì)表達(dá)luciferase，加入檢測(cè)試劑后會(huì)出現(xiàn)信號(hào)值，血清未起到阻斷假病毒感染細(xì)胞的生理學(xué)作用，血清中沒有中和抗體。如果加入檢測(cè)試劑后信號(hào)值降低，則血清中存在中和抗體，血清中的中和抗體阻斷了假病毒感染細(xì)胞，通常人血清中中和抗體的強(qiáng)度和信號(hào)值呈負(fù)相關(guān)，通過(guò)血清樣品檢測(cè)信號(hào)值的轉(zhuǎn)化計(jì)算，可以獲得血清樣品中抗基因治療藥物的中和抗體滴度值。檢測(cè)原理和檢測(cè)體系如圖1所示：
圖1. 基因治療產(chǎn)品中和抗體檢測(cè)原理和體系
二、體液免疫原性中和抗體檢測(cè)方法難點(diǎn)解析
基于基因治療藥物的臨床生物分析實(shí)踐，中和抗體檢測(cè)在方法學(xué)開發(fā)和驗(yàn)證過(guò)程中有以下難點(diǎn)和要點(diǎn)。
討論：
由于基因治療藥物的病毒載體通常存在預(yù)存抗體的情況，閾值并非通過(guò)試驗(yàn)測(cè)定，閾值通常定義為陰性對(duì)照的一半，樣品分析通常需要進(jìn)行梯度稀釋匯報(bào)滴度值，因此整個(gè)檢測(cè)體系的構(gòu)建和數(shù)據(jù)結(jié)果的解釋相對(duì)常規(guī)免疫原性檢測(cè)會(huì)更復(fù)雜，需要有健全的方法學(xué)驗(yàn)證和數(shù)據(jù)匯報(bào)體系。
臨床樣品中的血清通常含有促進(jìn)病毒（如AAV2/8/9）感染細(xì)胞的作用，如圖2所示，在人血清體系中比在培養(yǎng)基體系，AAV2的感染效率提高了5-10倍。在檢測(cè)體系中人血清的基質(zhì)成分會(huì)導(dǎo)致信號(hào)的增加，人血清中的中和抗體會(huì)導(dǎo)致信號(hào)的減少，檢測(cè)方法中存在兩個(gè)拮抗的變量可能會(huì)導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果失真，特別是樣品進(jìn)行梯度稀釋時(shí)，人血清的比例會(huì)逐漸減少，促進(jìn)作用逐漸減弱血清梯度稀釋造成的不均一的基質(zhì)影響，會(huì)導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果的失真以及數(shù)據(jù)解讀困難。由于預(yù)存抗體的存在，常規(guī)PK方法中使用一定比例人血清稀釋液進(jìn)行樣品稀釋的手段也會(huì)遇到問(wèn)題，需要有較為精妙的設(shè)計(jì)來(lái)排除人血清的干擾。
圖2. 人血清極大提高了AAV2的轉(zhuǎn)染效率
三、體液免疫原性中和抗體檢測(cè)方法要點(diǎn)解析
1.
中和抗體檢測(cè)滴度值通常會(huì)作為AAV Based療法病人入組篩查的標(biāo)準(zhǔn)，如圖3所示，展現(xiàn)了部分上市基因治療產(chǎn)品和國(guó)內(nèi)基因治療產(chǎn)品的入排標(biāo)準(zhǔn)。就中和抗體的方法學(xué)而言，中和抗體分析方法受到試驗(yàn)體系如加入的細(xì)胞量，病毒量，MOI，病毒感染細(xì)胞時(shí)間不一樣的影響，方法的靈敏度會(huì)不一樣，通常不同試驗(yàn)室方法的可比性和一致性較差。可能會(huì)出現(xiàn)同一樣品在不同實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行檢測(cè)，得到較大差異滴度值的情形。中和抗體檢測(cè)滴度值作為入組篩選標(biāo)準(zhǔn)需要謹(jǐn)慎進(jìn)行調(diào)研考察，需基于方法學(xué)的檢測(cè)數(shù)據(jù)進(jìn)行評(píng)估選擇。
圖3. 部分AAV藥物體液免疫抗體滴度入組
篩查標(biāo)準(zhǔn)
2.
應(yīng)選擇合適的中和抗體滴度值作為入組排除標(biāo)準(zhǔn)。中和抗體滴度值標(biāo)準(zhǔn)選擇過(guò)低，可能使藥物上市后獲益人群較少，中和抗體滴度值標(biāo)準(zhǔn)選擇過(guò)高，中和抗體可能會(huì)影響到藥物在人體的有效性和安全性，藥物臨床的成功率會(huì)受到影響。根據(jù)文獻(xiàn)記載，不同地域人群中AAV預(yù)存抗體的比例和強(qiáng)度均會(huì)不同，同時(shí)不同血清型的AAV其預(yù)存抗體的比例和強(qiáng)度也會(huì)不一樣，針對(duì)不同血清型的AAV載體需要基于當(dāng)前方法學(xué)中健康人群的AAV預(yù)存抗體的比例和強(qiáng)度進(jìn)行合適的稀釋倍數(shù)設(shè)計(jì)和樣品分析，以及基于當(dāng)?shù)亟】等巳后w中的中和抗體滴度來(lái)選擇合適的中和抗體滴度值作為入組排除標(biāo)準(zhǔn)。熙寧實(shí)驗(yàn)室對(duì)同一批健康人血清進(jìn)行了AAV2和AAV8的中和抗體滴度檢測(cè)，部分檢測(cè)結(jié)果如圖4。值得注意的是在AAV8滴度值小于5的健康個(gè)體中，其AAV2的滴度值均小于500，暗示著機(jī)體對(duì)不同血清型AAV之間可能存在交叉免疫的情況出現(xiàn)。
圖4. AAV預(yù)存抗體強(qiáng)度和健康群體比例
四、總結(jié)
中和抗體檢測(cè)是體液免疫檢測(cè)的重要一環(huán)，對(duì)于以病毒為載體的基因治療藥物，特別是以AAV為載體，機(jī)體預(yù)存的中和抗體是影響基因治療藥物有效性和安全性的關(guān)鍵因素。在病人入組篩選時(shí)，中和抗體滴度作為入組篩查的標(biāo)準(zhǔn)，甚至?xí)绊懙剿幬锏呐R床藥效評(píng)估，以及未來(lái)上市后的市場(chǎng)范圍。
以假病毒感染細(xì)胞作為檢測(cè)模型的中和抗體檢測(cè)方法在臨床檢測(cè)過(guò)程中，血清的基質(zhì)干擾是方法學(xué)難點(diǎn)，血清基質(zhì)的存在會(huì)促進(jìn)病毒感染細(xì)胞，同時(shí)血清中的中和抗體會(huì)抑制病毒感染細(xì)胞，在一個(gè)檢測(cè)方法中同時(shí)存在兩個(gè)拮抗的變量時(shí)，檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性和一致性是很難保證的，熙寧生物基于巧妙的試驗(yàn)設(shè)計(jì)，將個(gè)體血清對(duì)檢測(cè)體系的干擾進(jìn)行了排除，使檢測(cè)方法能夠單一變量反應(yīng)中和抗體滴度的強(qiáng)弱。經(jīng)熙寧生物進(jìn)行了充分驗(yàn)證的方法能夠真實(shí)準(zhǔn)確的進(jìn)行血清樣品的中和抗體滴度檢測(cè)。
同時(shí)熙寧生物有較為廣闊的人健康群體基質(zhì)庫(kù)，對(duì)不同血清型AAV在人群中中和抗體滴度強(qiáng)度和分布比例有極為清晰的認(rèn)知，能夠和客戶共同協(xié)作進(jìn)行病人入組中和抗體滴度閾值確認(rèn)的工作，助力AAV基因治療藥物的臨床研發(fā)。
基因治療作為熱門的新興療法，近些年發(fā)展迅速。同時(shí)，基因治療藥物研發(fā)需求多樣化、技術(shù)復(fù)雜度高的特點(diǎn)，也對(duì)檢測(cè)分析帶來(lái)巨大挑戰(zhàn)。熙寧生物搭建了基于基因治療藥物檢測(cè)需求的基因檢測(cè)平臺(tái)、細(xì)胞/病毒檢測(cè)平臺(tái)、流式檢測(cè)平臺(tái)和免疫檢測(cè)平臺(tái)等，能夠滿足研發(fā)項(xiàng)目在不同階段的在生物分析需求。團(tuán)隊(duì)專注于GCT領(lǐng)域，積累了豐富的實(shí)戰(zhàn)經(jīng)驗(yàn)和專業(yè)的技術(shù)服務(wù)能力，通過(guò)qPCR/ddPCR技術(shù)、細(xì)胞法中和抗體檢測(cè)技術(shù)、ELISPOT細(xì)胞免疫原性檢測(cè)技術(shù)、流式檢測(cè)技術(shù)、ELISA/MSD檢測(cè)技術(shù)等多平臺(tái)技術(shù)互聯(lián)，打通技術(shù)隔閡，真正實(shí)現(xiàn)“一個(gè)臨床/項(xiàng)目，一個(gè)生物分析實(shí)驗(yàn)室，一個(gè)技術(shù)項(xiàng)目團(tuán)隊(duì)”的服務(wù)方式，為基因治療產(chǎn)品生物分析提供完整解決方案。
