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上文熙寧小課-第146期 | 免疫組庫測序打開藥物研發(fā)新視野（五）：TCR免疫組庫測序在腫瘤免疫治療中的應用（上）以TRB為例，從克隆多樣性、CDR3長度分布、V-J基因使用頻率分布等方面對單個樣本的TCR免疫組庫測序結(jié)果進行了簡單展示。
本文將對受檢者*經(jīng)治療后的不同時間節(jié)點的樣本進行 T 細胞受體基因克隆鑒定檢測，對每個樣本 TCR 的克隆比例、克隆多樣性、V/J 基因的使用頻率進行統(tǒng)計，識別樣本間的共有克隆，并追蹤不同樣本 TCR 指標的動態(tài)變化，如克隆總數(shù)、克隆類型、多樣性指數(shù)、克隆豐度等，以TRB為例進行展示（注：圖示中所有數(shù)據(jù)均來自虛擬樣本）。
PART 01
免疫監(jiān)測為腫瘤免疫治療提供臨床指導
在腫瘤免疫治療中，通過 TCR 免疫組庫測序追蹤同一個患者在不同時間節(jié)點的T細胞克隆類型與比例變化，可以提供非常重要的臨床信息和指導意義：
·
治療反應監(jiān)測：觀察到特定的TCR克隆在治療前后或治療期間的相對穩(wěn)定或顯著擴增，可能指示這些克隆對應T細胞具有有效的抗腫瘤活性，這對于評估免疫治療效果至關重要。若治療后這些效應T細胞克隆比例上升，則提示治療起效，反之則可能提示治療失敗或耐藥；
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免疫監(jiān)測與復發(fā)預警：如果治療后原本消失或減少的腫瘤相關TCR克隆再次升高，可能預示著腫瘤復發(fā)或進展。通過實時監(jiān)測TCR譜的變化，可以提前發(fā)現(xiàn)病情變化，指導臨床決策；
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治療反應預測：識別出患者體內(nèi)預先存在的抗腫瘤TCR克隆，可以預測患者對某些免疫療法（如免疫檢查點抑制劑、T細胞受體工程改造療法等）的響應可能性；
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免疫逃逸機制研究：分析腫瘤微環(huán)境中TCR克隆的動態(tài)變化，有助于揭示腫瘤如何通過免疫編輯過程實現(xiàn)免疫逃逸，從而改進現(xiàn)有治療策略，開發(fā)新的治療手段。
PART 02
時序樣本TCR免疫組庫測序結(jié)果
注：下圖中的樣本信息和結(jié)果均來自模擬數(shù)據(jù)
2.1 樣本間共有克隆分析
統(tǒng)計多個樣本的共有克隆的數(shù)目，結(jié)果見圖1，根據(jù)多個樣本的CDR3序列及頻率繪制聚類熱圖，結(jié)果見圖2。
圖1 多個樣本克隆類型一致性venn圖
上圖為多個樣本中克隆類型一致性分布的韋恩圖。該圖支持2~5個樣本的可視化，圖中的數(shù)字表示重疊樣本的共有克隆的數(shù)目。
圖2 多個樣本共有克隆表達量聚類熱圖
上圖為不同樣本的克隆頻率聚類熱圖，其中，每一列為一個樣本，每一行為一種克隆。按克隆類型進行聚類，反應樣本間的克隆分布的相似性。藍色表示該克隆在對應樣本中克隆頻率較高，黃色表示該克隆在對應樣本中克隆頻率較低。
不同樣本中可能存在相同的克隆，依據(jù)克隆在樣本中共同存在的情況，有助于分析組間、組內(nèi)的差異和共性，有助于分析尋找疾病特異性克隆。
如果一個或幾個特定的T細胞克隆在治療前后的不同樣本中持續(xù)存在且比例增加，這可能表明這些克隆具有針對腫瘤的有效免疫反應。特別是在免疫治療后，同一克隆的增多可能代表這些T細胞成功地識別并消滅了腫瘤細胞，提示治療有效。
若在治療后較長時間內(nèi)，仍然能在患者體內(nèi)檢測到相同的效應T細胞克隆，尤其是那些腫瘤特異性T細胞克隆，這可能意味著患者已經(jīng)建立了持久的免疫記憶，有利于防止腫瘤復發(fā)。
相反，若治療后，原本預期應被激活的特定克隆并未顯著擴增或反而減少，這可能暗示腫瘤出現(xiàn)了免疫逃逸機制或者患者對當前治療不敏感，提示治療可能無效或產(chǎn)生了耐藥性。
2.2 樣本間 V/J 基因使用頻率分析
統(tǒng)計每個樣本中 V，J 基因的使用頻率，結(jié)果見圖3 與圖4。
圖3 不同樣本V基因頻率分布柱狀圖
上圖為不同樣本的 V 基因頻率分布柱狀圖，其中，X軸表示不同的 V 基因，Y軸表示克隆頻率，不同的樣本由不同顏色表示。
圖4 不同樣本J基因頻率分布柱狀圖
上圖為不同樣本的 J 基因頻率分布柱狀圖，其中，X軸表示不同的 J 基因，Y軸表示克隆頻率，不同的樣本由不同顏色表示。
當免疫治療有效時，通常伴隨著腫瘤特異性T細胞的激活和擴增。這些T細胞可能具有特定的TCR結(jié)構，其V和J基因的使用頻率會在治療后顯著增加。因此，如果發(fā)現(xiàn)某些V/J基因組合的頻率在治療后有所升高，可能說明這些T細胞正積極地參與對抗腫瘤，從而提示治療效果良好。
另一方面，如果預期應該對治療產(chǎn)生反應的特定V/J基因使用頻率未見明顯上升，甚至減少，可能提示腫瘤正在通過免疫逃逸機制躲避T細胞攻擊，或者治療未能有效激活相應的抗腫瘤T細胞克隆，從而提示治療效果不佳或產(chǎn)生耐藥性。
2.3 多時間節(jié)點動態(tài)分析
由于樣本存在時序關系，為展示不同時間點樣本間 TCR 重組序列的變化情況，對多個樣本的克隆數(shù)、克隆類型、多樣性指數(shù)、克隆分率分布等進行統(tǒng)計，見圖5-7，篩選了每個樣本表達量最高的前20條克隆組成新的克隆群，追蹤該克隆群體在不同樣本間克隆頻率的變化，見圖8。
圖5 不同時間節(jié)點樣本高頻克隆的TCR指標動態(tài)變化折線圖
上圖為不同時間節(jié)點樣本的 TCR 克隆數(shù)統(tǒng)計圖。X軸為不同時間節(jié)點的樣本，柱形圖展示了不同樣本的 TRB 的克隆類型與克隆總數(shù)，Y軸為Log10（克隆數(shù)）。
圖6 多樣性指數(shù)變化折線圖
上圖為不同時間節(jié)點樣本的 TCR 多樣性指數(shù)統(tǒng)計圖。X軸為不同時間節(jié)點的樣本，折線圖展示了不同樣本的 TRB 的克隆克隆多樣性指數(shù)。
圖7 不同樣本的克隆豐度組成累計頻率分布圖
上圖為多個樣本的克隆豐度的密度分布圖。其中 X 軸 Log10(克隆頻率)， Y 軸表示處于該區(qū)間的克隆頻率的百分比。反應不同樣本的克隆豐度組成變化情況。
圖8 不同時間節(jié)點樣本高頻克隆的頻率變化追蹤圖
上圖為時序樣本特定克隆的堆疊面積圖，其中，X軸表示不同的時間節(jié)點（不同樣本），陰影面積的大小反應克隆頻率的大小。不同樣本間的共有克隆由相同的顏色表示。
在腫瘤免疫治療中，不同樣本中T細胞克隆的豐度和多樣性指數(shù)的變化能夠從一定程度反映腫瘤治療的臨床效果。
有效的免疫治療可能導致T細胞庫的多樣性增加，這是因為有更多的腫瘤特異性T細胞被激活和擴增，增加了整體T細胞克隆的多樣性，這是免疫系統(tǒng)響應的一種積極信號；在某些情況下，治療后T細胞多樣性降低可能是因為少數(shù)高效應T細胞克隆占據(jù)了優(yōu)勢，這在一定程度上可能反映出了治療的成功，但如果整體多樣性降低過于顯著，也可能提示免疫系統(tǒng)整體功能受限或偏向單一反應，不利于長期控制腫瘤；對于免疫衰老或腫瘤導致的T細胞多樣性喪失，治療后多樣性趨于穩(wěn)定或恢復，可能表明治療有助于重建健康的免疫平衡，有利于治療效果的持久性。
通過全面分析克隆豐度和多樣性指數(shù)的變化，可以幫助臨床醫(yī)生評估治療策略的有效性、預后以及耐藥性，同時也為個體化治療方案的制定提供了科學依據(jù)。
2.4 TILs 來源的克隆殘留比例追蹤
在腫瘤微環(huán)境中，TILs的克隆組成反映了機體對腫瘤的免疫反應強度和特異性。在 TILs（Tumor-Infiltrating Lymphocytes） 介導的腫瘤免疫治療過程中對TILs在血液和腫瘤組織中的殘留量、活性和克隆分布的連續(xù)監(jiān)測有助于了解治療效果和調(diào)整后續(xù)治療策略。
圖9 樣本TILs來源的TRB克隆殘留比例折線圖
上圖為樣本TILs 來源的 TRB 克隆殘留比例折線圖，其中，X軸表示不同的時間節(jié)點（不同樣本），縱坐標表示克隆殘留比例（%）。
TILs 注射后在患者體內(nèi)的殘留比例變化取決于多種復雜因素，包括體內(nèi)歸巢與增殖、免疫抑制微環(huán)境、免疫抑制劑的聯(lián)合使用、TILs的質(zhì)量和純度、患者個體差異等，這些因素相互作用影響TILs在體內(nèi)的持久性、增殖能力、抗腫瘤活性以及最終的治療效果。
2.5 樣本相似性計算及聚類
當樣本數(shù)>3時，統(tǒng)計樣本間的克隆序列分布相似性指數(shù)：Morisita’s overlap index。根據(jù)相似性對樣本進行聚類，結(jié)果見圖10。Morisita 重疊指數(shù)的計算公式為：
xi 是克隆 i 在一個克隆總數(shù)為 X 的樣本中出現(xiàn)的次數(shù)。
yi 是克隆 i 在一個克隆總數(shù)為 Y 的樣本中出現(xiàn)的次數(shù)。
S 是克隆類型總數(shù)。
圖10 多樣本相似性聚類樹狀圖
上圖展示了多個樣本的樹狀結(jié)構，分支長度顯示了樣本克隆序列之間的距離。
不同治療組間的聚類可以區(qū)分出對治療響應良好和不良的患者群體，通過比較治療前后的TCR譜系變化，可以判斷治療是否有效激活了腫瘤特異性T細胞反應；不同類型的腫瘤或疾病階段具有獨特的TCR譜系特征，聚類分析可以幫助細化疾病分型，甚至預測疾病進展或轉(zhuǎn)歸；分析腫瘤樣本和正常對照之間的TCR克隆差異，可以識別出可能與腫瘤免疫逃逸相關的TCR克隆，從而深入了解腫瘤如何規(guī)避免疫監(jiān)視。多組樣本TCR免疫組庫測序的樣本聚類分析有助于深入了解免疫系統(tǒng)在腫瘤發(fā)病和治療過程中的動態(tài)變化，為臨床提供更精準的診斷、預后判斷以及個體化治療方案設計。
PART 03
小結(jié)
免疫組庫檢測方法揭示了免疫系統(tǒng)多樣性和克隆擴增狀態(tài)，除了用于腫瘤的免疫治療外，還可用于研究病原體感染過程中宿主免疫反應的多樣性、識別關鍵抗體序列；探究自身免疫疾病的發(fā)病機制及其潛在治療靶點；研究移植后宿主對移植物的免疫反應，為優(yōu)化移植后免疫抑制方案提供依據(jù)。由此可知，免疫組庫檢測技術已經(jīng)成為現(xiàn)代生物醫(yī)藥研發(fā)的重要工具，不僅促進了免疫療法的進步，也在多種治療領域發(fā)揮了關鍵作用。
熙寧|精翰NGS實驗室應用基于多重PCR建庫的免疫組庫檢測方法特異性地擴增TCR/Ig受體鏈編碼基因（TRB、TRD、TRG，以及IgH、IgL、IgK），檢測T/B細胞受體基因的克隆性重排，在時序樣本檢測中，通過檢測患者體內(nèi)TCR譜系的變化來評估治療效果以及跟蹤疾病進展或復發(fā)。本檢測方法已經(jīng)經(jīng)過了完善的性能驗證，可以供申辦方直接使用。
熙寧|精翰NGS實驗室依據(jù)CAP質(zhì)量的要求，建立了完善的質(zhì)量體系。實驗室擁有NextSeq CN500測序儀，支持本地測序，且多次滿分通過CAP的能力驗證。按照質(zhì)量體系的要求，實驗室建立了豐富的檢測方法，全面支撐藥物的安全性評估、治療效果評估、入組篩查和生物標志物的探索等，在藥物研發(fā)的各個環(huán)節(jié)發(fā)揮重要作用：
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以慢病毒為載體的CAR-T細胞治療中，識別有致瘤性的或者其他潛在危險的整合位點，評估整合事件的多樣性和偏好性，輔助評估藥物潛在的安全性風險；
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通過對腫瘤微小殘留病灶（MRD）的檢測，評估藥物治療效果并提示預后，提前提示復發(fā)風險并指導后續(xù)干預；
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通過基因組和轉(zhuǎn)錄組測序，幫助申辦方識別與疾病關聯(lián)的基因突變、融合突變和拷貝數(shù)變異等，識別受試者藥物靶點變異情況，以及與藥物轉(zhuǎn)運、代謝和相關信號通路的基因變化，從而指導患者入排，發(fā)現(xiàn)藥物研發(fā)的潛在靶點和生物標志物，并指導耐藥機制研究和新的治療策略開發(fā)；
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評估候選藥物對基因表達的影響，篩選出對特定靶標有顯著作用的化合物，同時通過分析藥物處理前后基因表達變化，優(yōu)化藥物的劑量、作用機制和潛在副作用。
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