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隨著腫瘤免疫療法的興起，免疫系統(tǒng)在腫瘤研究中的作用受到了極大的關(guān)注。免疫系統(tǒng)的一些組分或其變化，已被用于腫瘤預(yù)后或預(yù)測腫瘤免疫治療的療效。例如，腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞的存在被證明與一些癌癥的良好預(yù)后直接相關(guān)[1]。然而，盡管一些患者存在高豐度的腫瘤浸潤性淋巴細(xì)胞，但并不能保證有良好的療效。因此，需要更深入地了解腫瘤組織中免疫細(xì)胞的類型及其激活狀態(tài)、功能和特異性。作為適應(yīng)性免疫的關(guān)鍵細(xì)胞效應(yīng)器，T細(xì)胞的抗原特異性由T細(xì)胞受體（TCR）決定，這意味著TCR庫（TCR repertoire）可以反應(yīng)人類免疫系統(tǒng)的狀態(tài)[2]。因此，TCR庫被認(rèn)為是一種有前景的生物標(biāo)志物，對TCR庫的研究有助于表征腫瘤細(xì)胞與宿主適應(yīng)性免疫系統(tǒng)的相互作用，指導(dǎo)如何利用現(xiàn)有或新的治療方法有效地調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)，以及如何更好地預(yù)測腫瘤預(yù)后。
PART 01
TCR庫作為癌癥預(yù)后的生物標(biāo)志物
在一項研究中，Charles等采用半定量多重PCR方法對44例I-IV期黑色素瘤患者的外周血和其中7例患者的轉(zhuǎn)移性淋巴結(jié)樣本的TCR庫多樣性進(jìn)行了研究，并探討其對臨床預(yù)后的潛在預(yù)測價值[3]。作者使用兩個參數(shù)對TCR多樣性進(jìn)行量化：反映V-J重排數(shù)量的多樣性豐富度（diversity richness，DR）和反映種群克隆性的多樣性均勻度（diversity evenness，DE）。作者根據(jù)DR和DE值分析患者的無進(jìn)展生存期（PFS）和總生存期（OS），發(fā)現(xiàn)患者外周血中較高的TCR庫多樣性（DR和DE參數(shù)）與較長的PFS相關(guān)，而多樣性對患者OS沒有顯著影響（PFS和OS均從采樣時間開始計算）（圖1）。作者還進(jìn)一步比較了7例患者血液和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移瘤中TCR庫的多樣性（圖2）。盡管總體DR和DE值在血液和腫瘤之間無顯著差異，但對個體進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，患者1在血液和腫瘤中均具有最低DR值，腫瘤中具有最低DE值，在采樣后疾病進(jìn)展迅速并在采樣四個月后死亡；相反，具有良好預(yù)后和較長生存期（接近4年）的患者8在血液和腫瘤中均表現(xiàn)出更高的TCR庫多樣性。綜上，這項研究表明黑色素瘤患者血液和腫瘤中TCR庫的多樣性具有潛在的預(yù)后價值。
圖1 DR和DE參數(shù)的數(shù)值高預(yù)示更長的PFS[3]。通過ImmunTraCkeR?評估黑色素瘤患者血液中TCR庫的多樣性，并評估其對臨床結(jié)果的影響: (a) 低DR值 (<90%, n="12)和高DR值">90%, n = 32)患者的PFS (左圖)和OS (右圖)對比; (b) DE值低于或高于中位數(shù)的患者的PFS (左圖)和OS (右圖)的對比(n = 44)。采用log-rank檢驗進(jìn)行分析
圖2 淋巴結(jié)（LN）轉(zhuǎn)移瘤的多樣性可能為臨床結(jié)果提供有用信息[3]。通過ImmunTraCkeR?評估黑色素瘤患者血液和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移瘤中TCR庫的多樣性（計算多樣性豐富度和均勻度）。血液和淋巴結(jié)DR值(左圖)和DE值(右圖)的對比
除了黑色素瘤，TCR庫對于乳腺癌、宮頸癌、胃癌等惡性腫瘤同樣具有一定預(yù)后價值（表1）。總的來說，更高的TCR多樣性意味著免疫系統(tǒng)具有更好協(xié)調(diào)抗腫瘤反應(yīng)的能力，所以在健康個體或疾病進(jìn)展較好的患者中，TCR庫的多樣性會更高。
表1 TCR庫多樣性在腫瘤預(yù)后中的作用[1]
PART 02
TCR庫作為ICIs治療的預(yù)測生物標(biāo)志物
免疫檢查點抑制劑（ICIs）的使用已被證明可以提高多種類型腫瘤患者的生存期。到目前為止，用于預(yù)測ICIs療效的生物標(biāo)志物主要包括PD-L1表達(dá)、腫瘤突變負(fù)荷（TMB）和腫瘤浸潤T細(xì)胞。近年來，一些研究試圖探索TCR庫多樣性和克隆性的改變與ICIs治療期間建立的保護(hù)性腫瘤特異性反應(yīng)之間的關(guān)系，主要集中在靶向CTLA-4和PD-1的單克隆抗體這兩類ICIs對TCR庫多樣性的影響（表2）[1, 4]。由于難以獲得縱向腫瘤組織樣本，這些研究大多使用循環(huán)T細(xì)胞，少數(shù)使用腫瘤浸潤T細(xì)胞。
表2 不同腫瘤研究中ICIs治療后的TCR庫分析[1]
在一項試點研究中，Postow等人分析了12例轉(zhuǎn)移性黑色素瘤患者在接受ipilimumab（anti-CTLA-4 antibody）治療前的外周血TCR庫多樣性，以確定治療前TCR庫多樣性是否與ipilimumab治療的臨床結(jié)果相關(guān)[5]。作者通過豐富度（richness，觀察到的V-J重排）和均勻度（evenness，特定V-J重排頻率之間的相似性）這兩個參數(shù)來研究TCR庫的多樣性。臨床獲益通過ipilimumab開始治療后腫瘤負(fù)荷減輕或疾病穩(wěn)定時間延長至少9個月的證據(jù)來確定。結(jié)果顯示（圖3），有無臨床獲益的患者在TCR庫豐富度（p = 0.033）和均勻度（p = 0.028）上都存在顯著差異，低豐富度（n = 0/5, p = 0.081）和低均勻度（n = 0/7, p = 0.01）患者均沒有臨床獲益。該研究表明，轉(zhuǎn)移性黑色素瘤患者外周血中基線TCR多樣性與ipilimumab治療的臨床結(jié)果相關(guān)。
圖3 A，有臨床獲益的患者在基線時TCR庫的豐富度更高(p = 0.033)；B，有臨床獲益的患者在基線時TCR庫的均勻度更高(p = 0.028)[5]
此外，一些研究發(fā)現(xiàn)抗CTLA-4治療可以增加外周血中TCR庫的多樣性。例如，為了評價tremelimumab阻斷CTLA4對PBMC的免疫調(diào)節(jié)作用，Robert等人利用NGS評估了21例轉(zhuǎn)移性黑色素瘤患者在接受tremelimumab治療前、治療30天和60天后，PBMC細(xì)胞中TCR V-beta CDR3的變化[6]。結(jié)果顯示（圖4），接受tremelimumab治療后，19例患者TCR V-beta CDR3的unique productive sequences中位數(shù)增加了30%，另外2例中位數(shù)下降30%；治療后的豐富度（P < 0.01）和Shannon多樣性指數(shù)（P < 0.04）變化顯著。相比之下，從4名健康人的TCR V-beta CDR3多樣性在1年內(nèi)沒有顯著變化。這項研究說明用tremelimumab阻斷CTLA4可以使外周T細(xì)胞庫多樣化，闡明這類抗體如何調(diào)節(jié)人類的免疫系統(tǒng)。
圖4 Unique productive sequences絕對數(shù)值的變化[6]。A，來自21名黑色素瘤患者(GA，黑色)和4名健康人 (HD，灰色)的基線和tremelimumab治療后樣本之間的變化。B，標(biāo)準(zhǔn)化的TCR V-beta CDR3庫多樣性。分析比較PBMC樣本的基線和tremelimumab治療后CDR3庫的變化，這些數(shù)值進(jìn)行歸一化，以可比性的方式顯示治療后的增加和減少
關(guān)于抗PD-(L)-1治療，一些研究也證明了更高的基線外周TCR庫多樣性與臨床獲益之間的關(guān)聯(lián)。例如，Han等人對NSCLC患者PD-1+ CD8+ T細(xì)胞的TCRβ CDR3進(jìn)行測序，以研究其在預(yù)測NSCLC患者對抗PD-1/ PD-L1治療反應(yīng)中的作用（圖5）[7]。兩個獨立的隊列（隊列A，n = 25；隊列B，n = 15)分別作為發(fā)現(xiàn)組和驗證組。在隊列A中， ICB治療前PD-1+ CD8+ T細(xì)胞TCR庫多樣性高的患者對ICB治療表現(xiàn)出更優(yōu)的臨床響應(yīng)和更長的PFS（6.4個月vs 2.5個月，HR，0.39；95%[CI]，0.17-0.94；P = 0.021）。類似的結(jié)果在隊列B中也得到了驗證，說明外周血PD-1+ CD8+ T細(xì)胞中的TCR庫多樣性可以作為預(yù)測NSCLC對ICB治療結(jié)果的生物標(biāo)志物。
圖5 TCR庫多樣性與PD-1或PD-L1抑制劑治療的反應(yīng)和PFS的相關(guān)性[7]。A，隊列A中PD-1/PD- l1抑制劑治療后DC和PD亞組PD-1+ CD8+ TCR多樣性的比較(n = 25)。B，使用ROC曲線隊列A中區(qū)分PD患者和DC患者(n = 25)。C，隊列A的PFS通過PD-1+ CD8+ TCR庫多樣性進(jìn)行分層(n = 25)。D，隊列B的PFS通過PD-1+ CD8+ TCR多樣性進(jìn)行分層 (n = 15)。E，隊列A的OS通過PD-1+ CD8+ TCR庫多樣性進(jìn)行分層 (n = 25)。F，隊列B的OS通過PD-1+ CD8+ TCR庫多樣性進(jìn)行分層(n = 15)。G, TCR多樣性對判斷PD-1或PD- L1抑制劑的臨床反應(yīng)(DC vs PD)的敏感性和特異性(n = 40;DC, n = 23, PD, n = 17)
然而，Hogan等人在一項研究發(fā)現(xiàn)TCR庫多樣性與anti-PD-1治療結(jié)果存在負(fù)相關(guān)（圖6）[8]。在該研究中，作者采用multi-N-plex PCR技術(shù)測試了接受anti-CTLA4 (n = 42) 或anti-PD1 (n = 38)治療的黑色素瘤患者在治療前PBMC的TCR庫組合多樣性均勻度（DE50，其數(shù)值越低，代表TCR克隆越多，多樣性越少）。在多變量回歸模型中評估治療結(jié)果、臨床變量和DE50之間的相關(guān)性，并通過Fisher精確檢驗進(jìn)行驗證。結(jié)果顯示，低DE50數(shù)值預(yù)示著患者anti-PD-1治療有良好反應(yīng)和更長的PFS，但是對于anti-CTLA-4治療預(yù)示著較差的臨床獲益。不同研究結(jié)果的差異表明，需要更深入的研究，以助于更好地了解其他因素對TCR庫變化的影響。
圖6 治療前TCR多樣性的均勻度[8]。A，散點圖顯示對anti-CTLA-4治療有反應(yīng)或無反應(yīng)患者的基線DE50。N = 42。虛線，20.03%。B，散點圖顯示對anti-PD-1治療有反應(yīng)或無反應(yīng)患者的基線DE50水平。N = 38。虛線，20.4%。用Fisher精確檢驗計算P值
PART 03
小結(jié)
盡管缺乏對TCR庫如何影響癌癥發(fā)展的了解，但目前已有明確的證據(jù)表明，TCR庫在作為預(yù)測腫瘤進(jìn)展或預(yù)測ICIs治療效果的生物標(biāo)志物方面具有巨大的潛力。
熙寧|精翰NGS實驗室應(yīng)用基于多重PCR建庫的免疫組庫檢測方法特異性地擴(kuò)增TCR/Ig受體鏈編碼基因（TRB、TRD、TRG，以及IgH、IgL、IgK），檢測T/B細(xì)胞受體基因的克隆性重排，在時序樣本檢測中，通過檢測患者體內(nèi)TCR譜系的變化來評估治療效果以及跟蹤疾病進(jìn)展或復(fù)發(fā)。本檢測方法已經(jīng)經(jīng)過了完善的性能驗證，可以供申辦方直接使用。
熙寧|精翰NGS實驗室依據(jù)CAP質(zhì)量的要求，建立了完善的質(zhì)量體系。實驗室擁有NextSeq CN500測序儀，支持本地測序，且多次滿分通過CAP的能力驗證。按照質(zhì)量體系的要求，實驗室建立了豐富的檢測方法，全面支撐藥物的安全性評估、治療效果評估、入組篩查和生物標(biāo)志物的探索等，在藥物研發(fā)的各個環(huán)節(jié)發(fā)揮重要作用：
熙寧 | 精翰NGS平臺可提供的檢測服務(wù)
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以慢病毒為載體的CAR-T細(xì)胞治療中，識別有致瘤性的或者其他潛在危險的整合位點，評估整合事件的多樣性和偏好性，輔助評估藥物潛在的安全性風(fēng)險；
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過對腫瘤微小殘留病灶（MRD）的檢測，評估藥物治療效果并提示預(yù)后，提前提示復(fù)發(fā)風(fēng)險并指導(dǎo)后續(xù)干預(yù)；
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通過基因組和轉(zhuǎn)錄組測序，幫助申辦方識別與疾病關(guān)聯(lián)的基因突變、融合突變和拷貝數(shù)變異等，識別受試者藥物靶點變異情況，以及與藥物轉(zhuǎn)運(yùn)、代謝和相關(guān)信號通路的基因變化，從而指導(dǎo)患者入排，發(fā)現(xiàn)藥物研發(fā)的潛在靶點和生物標(biāo)志物，并指導(dǎo)耐藥機(jī)制研究和新的治療策略開發(fā)；
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評估候選藥物對基因表達(dá)的影響，篩選出對特定靶標(biāo)有顯著作用的化合物，同時通過分析藥物處理前后基因表達(dá)變化，優(yōu)化藥物的劑量、作用機(jī)制和潛在副作用。
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